Skip to content

Rozdzielczość łuszczycy po zablokowaniu aktywności biologicznej IL-15 w modelu myszy heteroprzeszczepu ad

4 tygodnie ago

737 words

W kilku przypadkach do immunizacji użyto IL-15 sprzężonej z hemocyjaniną skałoczepa (KLH) (Pierce Biotechnology, Rockford, Illinois, USA). Po kilku dawkach przypominających IL-15, surowice myszy badano na obecność ludzkich przeciwciał skierowanych przeciwko IL-15. Aby uzyskać hybrydomy, śledziona myszy i komórki węzłów chłonnych połączono z komórkami SP2 / 0 (33). ELISA w celu określenia wiązania swoistych wobec IL-15a przeciwciał przeciwko IL-15 i zmutowanych białek IL-15 D8S i D8SQ108S. Zmutowane białka IL-15 lub IL-15 D8SQ108S lub Q108S (dostarczone przez Immunex Corp, nr ref. 34) powleczono na płytkach ELISA. Pozostałe miejsca wiązania zostały zablokowane przez inkubację z PBS zawierającym 2% (obj./obj.) Surowicy kurzej (PBSC, Life Technologies, Paisley, Szkocja, Zjednoczone Królestwo) przez 60 minut. Seryjne rozcieńczenia przeciwciał specyficznych wobec IL-15a inkubowano w PBSC, uzupełniono 0,05% Tween-20 (PBSTC) i wykrywano anty-ludzkim IgG (anty-huIgG) Fc sprzężonym z peroksydazą chrzanową (Jackson, West Grove, Pennsylvania USA; 1/5000 rozcieńczony w PBSTC). Kwas 2,2 (3-azinobis-3-etylobenzotiazolino-sulfonowy (ABTS) (Roche Diagnostics, Mannheim, Niemcy) zastosowano jako podłoże według producentów. protokół. Receptor IL-15. konkursowy test ELISA. Receptor IL-15. (IL-15R3) (R & D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA) powleczono na płytkach ELISA. Po zablokowaniu i przemyciu IL-15 (50 (il, temperatura pokojowa [RT]; Immunex Corp.) dodano przez 10 minut, a następnie biotynylowane przeciwciało (50 ul) w różnych stężeniach (90 minut, RT). Płytki inkubowano (60 minut, RT) z peroksydazą streptawidyna-poli-chrzanowa (Sanquin, Amsterdam, Holandia) rozcieńczoną 1: 10 000 w PBSTC. Jako substrat zastosowano ABTS. Hodowla PBMC. Krew uzyskano przez nakłucie żyły od zdrowych ochotników po uzyskaniu świadomej zgody. Oczyszczanie PBMC przeprowadzono przez wirowanie w gradiencie gęstości stosując Ficoll-Isopaque (Pharmacia, Uppsala, Szwecja). PBMC hodowano w pożywce RPMI 1640 (BioWhittaker, Verviers, Belgia) uzupełnionej penicyliną (50 U / ml), streptomycyną (50 ug / ml), L-glutaminą (2 mM) (BioWhittaker) i 10% FCS (Optimum C241). , Multicell, Wisent Inc., St. Bruno, Quebec, Kanada). Wiązanie 146B7 z kompleksami IL-15Al-15R na komórkach Raji. Komórki chłoniaka Raji (ATCC, Manassas, Virginia, USA) preinkubowano z 10% ludzką połączoną surowicą AB (Sanquin) w buforze FACS (PBS, 0,05% BSA i 0,02% NaNO3), a następnie inkubowano z IL-15 (rozcieńczoną w FACS bufor z 10% ludzką surowicą AB) Po płukaniu dodano biotynylowane Ab (mAb 146B7 lub huIgGl / p) (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Holandia). Związane Abs zostały wykryte na przepływomierzu za pomocą streptawidyny-fikoerytryny (DAKO, Glostrup, Dania). Zahamowanie proliferacji PBMC indukowanej przez IL-15 i huIL-2 (3 lub TNF-a. wytwarzanie przez przeciwciała anty-IL-15. PBMC hodowano w trzech powtórzeniach w 96-studzienkowych płytkach z dnem w kształcie litery U (Nalgene Nunc, Rochester, New York, USA), 1,5 x 105 komórek na dołek w obecności lub nieobecności różnych stężeń huIL-2 (Chiron, Amsterdam, The Holandia) lub IL-15 (Immunex) i przeciwciała anty-IL-15 (mAb 146B7 lub 404E4) lub przeciwciało kontrolujące izotyp w pożywce RPMI 1640 z 2 mM L-glutaminy, 50 IU / ml penicyliny, 50. G / ml streptomycyny ( Life Technologies) i 10% dezaktywowanych termicznie FCS (HyClone, South Logan, Utah, USA). Komórki inkubowano przez 72 godziny w 37 ° C i 5% CO2. Proliferację oznaczano ilościowo przy użyciu kolorymetrycznego testu ELISA proliferacji komórek BrdU (Roche Diagnostics). Indukcja apoptozy PBMC przez mAb 146B7. PBMC hodowano w 96-studzienkowych płytkach z dnem w kształcie litery U (Nalgene Nunc), 1,5 x 105 komórek na studzienkę w obecności lub przy braku 5 ng / ml IL-15 (Immunex) i 10 ug / ml anty-IL-15. przeciwciało (mAb 146B7) lub 10 .g / ml ludzkiego kontrolnego przeciwciała izotypowego (mAb anty-KLH). Apoptotis oceniano ilościowo po 5 dniach, stosując zestaw do wykrywania apoptozy (BD Biosciences, San Diego, California, USA). Barwienie komórek za pomocą kombinacji aneksyny V-FITC i jodku propidyny (PI) przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi wykrywania komórek żywych (aneksyna V-FITCneg / PIneg), wczesnych apoptotycznych (aneksyna V-FITCpos / PIneg) oraz późne komórki apoptotyczne (aneksyna V-FITCpos / PIpos). Specyficzne markery komórkowe wykorzystano do zbadania apoptotycznego działania mAb 146B7 na określone populacje komórek. Komórki NK wybrano przez bramkowanie komórek CD8posCD56pos za pomocą cytometrii przepływowej (stosując przeciwciało swoiste dla CD8 (klon RPA-T8) i CD56 + (klon B159), komórki T wybrano przez bramkowanie komórek CD3pos (stosując przeciwciało swoiste dla CD3, klon UCHT1); komórki selekcjonowano przez bramkowanie komórek CD20pos za pomocą cytometrii przepływowej (stosując specyficzne przeciwciało CD20 + (klon 2H7), wszystkie przeciwciała stosowane do cytometrii przepływowej uzyskano z BD Biosciences)
[więcej w: dieta po operacji ginekologicznej, zerwanie więzadła krzyżowego przedniego, amc esk ]
[hasła pokrewne: projekt ustawy o zdrowiu publicznym, apteka hygea zielona góra, zaburzenia afektywne dwubiegunowe ]