Skip to content

Noworodkowe komórki NK celują w nabłonek kanału mysiego poprzez Nkg2d i powodują uszkodzenie tkanki w doświadczalnej atrezji dróg żółciowych ad 8

3 miesiące ago

787 words

Liczbę myszy w każdym eksperymencie przedstawiono w wynikach, w tabeli lub w legendach figur. Instytucjonalny Komitet ds. Pielęgnacji i Użytkowania Zwierząt w Cincinnati Children s Research Foundation zatwierdził wszystkie protokoły dotyczące zwierząt. Analiza cytometrii przepływowej i barwienie cytokin. W chwili składania ofiar, noworodki wątroby zostały oczyszczone z krwi przez wlew PBS przez żyłę wrotną. Następnie izolowano komórki jednojądrzaste z wątroby lub z pozawątrobowych dróg żółciowych / pęcherzyków żółciowych przez delikatne mielenie, przepuszczanie przez 40-.m sitko komórek, odwirowanie przy 270 g w 4 ° C i lizę czerwonych krwinek, jak opisano wcześniej (9). Noworodkowe drogi żółciowe / pęcherze żółciowe przetwarzano w grupach o masie 15-20 z powodu ich bardzo małych rozmiarów. Komórki NK oczyszczono przy użyciu mikroperełek MACS CD49b (DX5) i Separator MidiMACS (Miltenyi Biotec). Fenotypowanie komórkowe w oparciu o markery powierzchni komórkowej przeprowadzono w sposób opisany uprzednio (8,9) przy użyciu następujących skoniugowanych z fluorochromem przeciwciał swoistych gatunkowo: anty-NK sprzężonych z FITC, PE lub allofikocyjaniną (APC) (CD49b; DX5; IgM), anty-CD3 (17A2, IgG2b), anty-CD4 (RM4-4, IgG2b), anty-CD8a (53-6.7, IgG2a) i anty-CD19 (1D3, IgG2a) zakupione od BD Biosciences; i anty-neutrofilowe CDllb (M1 / 70, IgG2b) i Gr-1 (RB6-8C5, IgG2b) i anty-makrofagowe CD11b (M1 / 70, IgG2b) i F4 / 80 (BM8, IgG2a) zakupione z eBioscience. Szczurze monoklonalne przeciwciało anty-mysz Nkg2d (191004, IgG2b) i szczurzą monoklonalne przeciwciało skierowane przeciwko mysiej specyficznej dla patelni Rae1 (186107, IgG2a) zakupiono od R & D Systems. Wewnątrzkomórkowe barwienie cytokinami wykonywano przy użyciu zestawu Cytofix / Cytoperm (z GolgiPlug) zgodnie z instrukcjami producenta (BD Biosciences), a następnie barwiono koniugatem PE przeciw Ifn. (XMG1.2, IgG1), anty-Tnf. (MP6-XT22, IgG1) (BD Biosciences), przeciwciała anty-granzyme B (16G6, IgG2b) i anty-perfyny (eBioOMAK-D, IgG2a) (eBioscience) lub odpowiednie kontrole izotypowe. Komórki zabarwione analizowano w dwu-laserowym cytometrze przepływowym FACSCalibur (BD Biosciences) i co najmniej 50 000 (w przypadku barwienia powierzchniowego) lub 150 000 (w przypadku barwienia wewnątrzkomórkowego) uzyskano dla wątroby i 10 000 zdarzeń dla dróg żółciowych. Dane analizowano za pomocą oprogramowania FlowJo (Tree Star), z populacjami komórek wybranymi według rozproszenia do przodu / z boku (z dala od resztek komórkowych i martwych komórek), bramkowano zgodnie z kontrolami izotypowymi w celu uwzględnienia fluorescencji tła i poddawano analizie wtórnej w oparciu o fluorescencję sygnały poszczególnych przeciwciał. W przypadku histogramów ustalono bramki z wykorzystaniem sygnałów ze znaczników na powierzchni komórki; mediana intensywności fluorescencji została określona zgodnie z kosztem wybranych cytokin; a nakładki wykresów zostały przeskalowane do liczby zdarzeń w określonym kwadrancie (reprezentowanym jako.% maksimum. na Figurze 3A) (9). Ekspresja genu. RNA wyizolowano z wątroby, zewnątrzwątrobowego przewodu żółciowego / pęcherzyka żółciowego lub oczyszczonych komórek NK z myszy wstrzykniętych RRV lub z solą fizjologiczną przy użyciu zestawu RNeasy Mini Kit, zgodnie z protokołem producenta (QIAGEN). Tę samą procedurę zastosowano do izolacji RNA z wątroby ludzkiej. Integralność RNA zweryfikowano za pomocą stosunków 260: 280 i elektroforezy w żelu agarozowym, a próbki poddano odwrotnej transkrypcji i zastosowano w ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (qPCR), jak opisano wcześniej (9). Startery i parametry cyklu qPCR w celu ilościowej oceny ekspresji mysich Ifng, Tnfa, Il12p40, Cxcl9, Cxcl10, Nkg2d, perforyny, granzymów A i B, Rae1a, Rae1b, Rae1g, Rae1d, Rae1e, Mult1 i H60 oraz ludzkich CD69, CRTAM, SLAM, granzymy A i B, NKG7, FCGR3B, KLRC2, KLRC4, ULBP1, ULBP2, ULBP3, KLRF1, MICB, NCR1, NCR2 i NCR3 są wymienione w Tabeli dodatkowej 2. Cytotoksyczność NK na cholangiocyty. U indukowanej przez komórki NK indukowanej lizie cholangiocytów zmierzono w teście uwalniania chromu, stosując 51Cr i mCl linii komórkowej cholangiocytów w różnych stosunkach efektor / cel, jak opisano poprzednio (9); linie komórkowe H2.35 (hepatocyty, ATCC-1995), MLE-12 (komórki nabłonka płucnego, ATCC-2110) i 4T1-MZ i 67-NR (komórki nabłonka guza myszy piersi, dostarczone przez David Manka, University of Cincinnati College of Medicine) zostały użyte jako kontrole. Aby określić, czy kontakt komórka-komórka był niezbędny do cytotoksyczności za pośrednictwem NK, test zmodyfikowano stosując 96-dołkowe urządzenie Transwell o wielkości porów 0,4 .m (Millipore) oddzielające komórki NK (w komorze Transwell) od 51Cr. oznaczone mCL (w dolnej komorze). W doświadczeniach testujących rolę Nkg2d w lizie komórek przeciwciało anty-mysie Nkg2d (CX5) lub jego izotyp (szczurzy IgG1) inkubowano z wątrobowymi komórkami NK w stężeniu 50 lub 100 .g / ml przez godzinę w 37 ° C. C przed użyciem komórek w teście lizy
[więcej w: szpital okulistyczny poznań, karma dla owczarka niemieckiego, testy osobowości psychologia ]
[patrz też: olej kokosowy wybielanie zębów, dieta po operacji ginekologicznej, uporczywy kaszel przyczyny ]