Skip to content

N-końcowa domena trombomoduliny maskuje białko grupy B1 o wysokiej ruchliwości, nowy mechanizm przeciwzapalny cd

2 tygodnie ago

717 words

Jak można było przewidzieć na podstawie tych wyników, stosując kompetycyjny test wiązania z unieruchomionym sRAGE-His, dodanie rhs-TM zmniejszyło, w sposób zależny od dawki, wiązanie HMGB1 do RAGE (Figura 1D). Biorąc pod uwagę nasze wyniki SPR analizujące oddziaływanie fragmentów TM z HMGB1 (patrz wyżej), wykorzystaliśmy te części TM w badaniach immunoprecypitacji. Po zastosowaniu protokołu immunoprecypitacji-immunoblottingu do mieszanin sRAGE-His i HMGB1 inkubowanych w obecności P-D1, intensywność pasma immunoreaktywnego HMGB1 zmniejszono (Figura 1C, ścieżka 4). Przeciwnie, fragment P-D2 + 3 TM nie hamował immunoprecypitacji-immunoblottingu kompleksu HMGB1-SRAGE (Figura 1C, linia 5). Zgodnie z tymi danymi dodanie rosnących ilości P-D1 do testu wiązania kompetycyjnego z sRAGE-His i HMGB1 doprowadziło do zależnego od dawki hamowania wiązania HMGB1 z RAGE, podczas gdy dodanie P-D2 + 3 było bez efekt (rysunek 1D). Aby ocenić, czy TM przechwyciłoby interakcję HMGB1 z RAGE w systemie komórkowym, przeprowadziliśmy doświadczenia wiązania z użyciem białka fuzyjnego HMGB1 (3 wiążącego maltozę białka (HMGB1-MBP) i komórek COS-7 stabilnie transfekowanych do nadekspresji RAGE . Komórki COS-7 transfekowane przez RAGE wykazywały znaczny wzrost antygenu RAGE na powierzchni komórki, w oparciu o immunofluorescencję i wzrost całkowitego antygenu RAGE, w oparciu o immunoblotting, w porównaniu z pozornie transfekowanymi kontrolami (Figura 1E, prawy panel). Inkubacja HMGB1-MBP z komórkami COS-7 transfekowanymi przez RAGE spowodowała zwiększenie asocjacji HMGB1-MBP z monowarstwą komórkową (w oparciu o test dla MBP) w porównaniu z próbką kontrolną pozornie transfekowaną (Figura 1E, lewy panel). Ten ostatni sygnał został zablokowany w obecności nadmiaru rhs-TM, HMGB1 (tj. Wolnego HMGB1 nie związanego z MBP), fragmentu P-Dl TM lub przeciwciała przeciw HMGB1 (Figura 1E, lewy panel). Natomiast fragment P-D2 + 3 był bez efektu. Podsumowując, dane te są zgodne z koncepcją, że część P-D1 TM pośredniczy w interakcji z HMGB1 i że wiązanie TM-HMGB1 zapobiega zaangażowaniu RAGE przez HMGB1. Zatem miejsca wiązania na HMGB1 dla RAGE i P-D1 wydają się nakładać. Ponadto, ponieważ aktywność kofaktora antykoagulantu TM znajduje się w fragmencie P-D2 + 3, wyniki te wskazują, że zdolność TM do wiązania HMGB1 wynika z P-D1 i różni się od zdolności antykoagulacyjnej. Wpływ TM na aktywację komórkową z udziałem HMGB1 in vitro. Przeprowadziliśmy kolejne eksperymenty z oczyszczonym białkiem HMGB1 i ludzkimi monocytarnymi komórkami THP-1, aby określić, czy TM może modulować właściwości HMGB1 (3 jako cytokinę prozapalną, co najmniej częściowo z powodu interakcji z RAGE. Inkubacja HMGB1 z komórkami THP-1 zwiększała ekspresję reportera zależnego od NF-kB (Fig. 2A). Hamowanie transkrypcji, w której pośredniczy NF-pB przez dodanie sRAGE, potwierdza pogląd, że oddziaływanie HMGB1-RAGE było zaangażowane w aktywację NF-kB. Ponadto, w obecności rhs-TM, indukowana HMGB1 ekspresja reportera NF-kB była tłumiona do poziomów tła (Figura 2A). Ponieważ obszary ROI odgrywają ważną rolę w szlaku sygnałowym prowadzącym do aktywacji NF-kB w niektórych przypadkach, ocenialiśmy, czy HMGB1 indukowałoby generowanie obszarów ROI w sposób zależny od RAGE, który mógłby być hamowany przez TM. Inkubacja HMGB1 z komórkami THP-1 obciążonymi dioctanem 2 (3, 7 (3-dichlorofluoresceiny (DCF-DA) dała wyraźny sygnał fluorescencyjny (nie pokazano). Dodanie rhs-TM silnie hamowało tworzenie fluorescencyjnego adduktu, podobnie jak dodanie P-D1. Przeciwnie, P-D2 + 3 i fragment TM obejmujący ostatnie 3 domeny EGF-podobne (E456) (skrócona forma TM obejmująca minimalną domenę antykoagulacyjną, odnośnik 6), fragmenty TM, które nie zawierają P-D1 , były bezskuteczne (nie pokazano). Tak więc aktywacja komórek THP-1 za pośrednictwem HMGB1, na poziomie aktywacji NF-kB i generowania obszarów ROI, może być tłumiona w obecności części P-D1 TM. Figura 2, przez D1, zapobiega prozapalnemu wpływowi HMGB1 in vitro. (A) Wpływ HMGB1 na transkrypcję genu zależnego od NF-pB2. Komórki THP-1 transfekowano konstruktem promotor-reporter NF-kB (SEAP). Następnie komórki THP-1 (106 komórek / ml) inkubowano przez 16 godzin w 37 ° C ze wskazanym stężeniem HMGB1 i określono ekspresję reportera. Dodano rekombinowaną sRAGE (10 nM) lub rhs-TM (TM; 100 nM), jak wskazano. (B) Fagocyty jednojądrzaste krwi obwodowej (106 komórek / ml) obciążono DCF-DA i inkubowano przez godzinę w 37 ° C w samej pożywce (N) lub z HMGB1 (10 nM) w pożywce
[podobne: apteka hygea zielona góra, magnetyczny rezonans jądrowy, uporczywy kaszel przyczyny ]
[przypisy: enrobioflox 10, zielnik hodowcy, karmienie gołębi pocztowych ]