Skip to content

N-końcowa domena trombomoduliny maskuje białko grupy B1 o wysokiej ruchliwości, nowy mechanizm przeciwzapalny ad

2 tygodnie ago

381 words

Jedną z charakterystycznych cech odpowiedzi zapalnej / prokoagulacyjnej gospodarza jest jego lokalizacja w miejscu uszkodzenia w ścianie naczynia. Zatem kofaktory przeciwzapalne i przeciwzakrzepowe będą prawdopodobnie odgrywać zasadniczą rolę w ograniczaniu kaskad odpowiedzi gospodarza do zaburzonego obszaru układu naczyniowego, potencjalnie poprzez ich zdolność do sekwestracji mediatorów stanu zapalnego. W tym kontekście wcześniejsze badania wykazały, że TM, kofaktor przeciwkoagulacyjny ściany naczynia, ma również właściwości przeciwzapalne zupełnie różne od jego wpływu na układ krzepnięcia (13-15). Rozważania te skłoniły nas do postawienia hipotezy, że TM może wiązać się z HMGB1, silnym mediatorem prozapalnym uwalnianym przez komórki nekrotyczne, zapobiegając w ten sposób rozprzestrzenianiu się bodźców wywoływanych przez mikrofogeny. Po inkubacji rekombinowanej ludzkiej rozpuszczalnej TM (rhs-TM) i HMGB1 następowało immunoprecypitację z IgG anty-HMGB1 i immunoblotting osadów immunologicznych za pomocą IgG anty-TM (Figura 1A). Immunoreaktywne pasmo TM obserwowano, gdy anty-HMGB1 IgG stosowano do immunoprecypitacji, ale nie wtedy, gdy podstawiono je immunoglobuliną IgG nieimmunologiczną (Figura 1A). Rysunek 1TM, poprzez D1, wiąże się z HMGB1. (A) W przypadku IP, rhs-TM (10 nM) i HMGB1 (10 nM) zmieszano i inkubowano, a następnie dodano kulki agarozowe białka A skoniugowane z IgG anty-HMGB1 (. HMGB1) lub nieimmunologiczną IgG (IgG). Immunoprecypitaty solubilizowano, a zredukowaną SDS-PAGE (10%) śledzono przez immunoblotting z przeciwciałem anty-TM (TM). (B) zewnątrzkomórkowe domeny TM. (C) Konkurencja pomiędzy TM i SRAGE w celu związania z HMGB1. Najpierw, sRAGE-His (10 nM) inkubowano z samym HMGB1 (10 nM, ścieżka 2) lub w obecności rhs-TM (TM, uM, ścieżka 3), P-Dl (1 uM, ścieżka 4). ) lub P-D2 + 3 (1 (M, ścieżka 5). Następnie dodano perełki żywicy niklowej, osady solubilizowano, a następnie SDS-PAGE (10%), a następnie IB, IgG AHMGB1. N, nietraktowane kontrole. (D) Wiązanie sRAGE-His (10 nM) do HMGB1 unieruchomionego na plastikowych płytkach badano z nietraktowanymi kontrolami, TM, P-D1 lub P-D2 + 3. (E) Lewy panel: Wiązanie HMGB1-MBP (1 nM) do transfekowanych przez RAGE (RAGE) lub pozornie transfekowanych (Mock) komórek COS-7 (104 komórek / studzienkę) oceniano w obecności nietraktowanych kontroli,. HMGB1. HMGB1, TM, P-D1 lub P-D2 + 3 (100 nM każdy). Przedstawione wyniki są reprezentatywne dla 4 replikowanych dołków. Prawy panel pokazuje ekspresję RAGE w komórkach COS-7 transfekowanych przez RAGE w porównaniu z komórkami COS-7 transfekowanymi przez IB (górny) i immunofluorescencję na nieutlenionych komórkach utrwalonych (niższe). * P <0,05, w porównaniu z grupą kontrolną. P <0,05, w porównaniu ze sparowanymi, nietraktowanymi kontrolami. W badaniach wiązania wykorzystujących powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR), przeprowadzonych w celu bezpośredniej oceny oddziaływania TM i unieruchomionego HMGB1, wykazano zależne od dawki wiązanie w zakresie nanomolowym (nie pokazano). W świetle wcześniejszych ustaleń wskazujących na działanie przeciwzapalne N-końcowej części TM (tj. W odróżnieniu od domeny antykoagulantu TM, pozycja 15), uznaliśmy region podobny do lektyny za możliwe miejsce interakcji HMGB1 z TM (rysunek 1B). W ten sposób wygenerowaliśmy rekombinowany polipeptyd odpowiadający D1 (P-D1), a drugi odpowiadający D2 i D3 (P-D2 + 3). Badania wiązania SPR z HMGB1 unieruchomionym na chipach czujnikowych i P-D1 w fazie ruchomej wykazały wiązanie nanomolowe porównywalne z obserwowanym dla TM o pełnej długości (nie pokazano). Przeciwnie, nie obserwowano wiązania pomiędzy HMGB1 i P-D2 + 3 (nie pokazano). Wpływ interakcji TM-HMGB1 na wiązanie HMGB1 do RAGE. RAGE jest receptorem transdukcji sygnału pośredniczącym, przynajmniej częściowo, w interakcji HMGB1 z pewnymi typami komórek prowadzącymi do aktywacji komórkowej (25). Dlatego ważne było zrozumienie wpływu wiązania TM na HMGB1 na interakcję HMGB1 z RAGE. W tych badaniach rozpuszczalny RAGE (sRAGE) z ogonem polihistydynowym (sRAGE-His) inkubowano z HMGB1 w obecności / nieobecności rhs-TM, i mieszaninę strącono przez dodanie kulek z żywicy niklowej do adsorpcji sRAGE-His ( Figura 1C). sRage obejmuje zewnątrzkomórkową domenę wiążącą ligand RAGE (26). W doświadczeniach w systemach komórkowych sRAGE służy jako pułapka przez wiązanie ligandów i zapobieganie ich interakcji z receptorem na powierzchni komórki (26). Immunoprecypitacja mieszanin sRAGE-His i HMGB1 z kulkami niklowymi, a następnie immunoblotting immunocytów z IgG anty-HMGB1, wykazała immunoreaktywne pasmo HMGB1 (Figura 1C, linia 2). Wynik ten jest zgodny z poprzednimi danymi wskazującymi, że RAGE wiąże się z HMGB1. Gdy sRAGE i HMGB1 były inkubowane w obecności TM, ta sama procedura immunobrecypitacji-immunoblotingu wykazała, że natężenie pasma HMGB1 zostało zmniejszone, co wskazuje, że sRAGE i TM konkurują o wiązanie z HMGB1 (Figura 1C, ścieżka 3) [więcej w: szpital okulistyczny poznań, amc esk, pzhgp nowa sól ] [więcej w: testy osobowości psychologia, amc esk, gołębniki świata ]