Skip to content

N-końcowa domena trombomoduliny maskuje białko grupy B1 o wysokiej ruchliwości, nowy mechanizm przeciwzapalny ad 8

4 tygodnie ago

717 words

Wpływ TM na oddziaływanie sRAGE-HMGB1 badano przez dodanie różnych peptydów pochodzących z TM w stężeniu 1. M dla każdego: rhs-TM, P-D1, P-D2 + 3 i E456. Peptydy pochodzące z TM użyte w tym badaniu przygotowano jak opisano wcześniej (6, 37). Ilościowy test do oceny zdolności peptydów pochodzących z TM do blokowania interakcji HMGB1-SRAGE został opracowany w następujący sposób. Do kowalencyjnego połączenia końca C HMGB1 użyto płytki o 96 zagłębieniach z aktywowanym aldehydem sprzężonym aminowo tworzywem sztucznym (Sumitomo Inc.). Następnie dodano sRAGE-His (10 nM) w PBS zawierającym 0,1% BSA, w obecności / nieobecności wskazanych stężeń (Figura 1C) peptydów pochodnych TM kompetycji. Związane oznaczenie sRAGE oznaczono ilościowo przy użyciu przeciwciała skierowanego do znacznika histydynowego sRAGE, zakupionego od Qiagen Inc. W teście wiązania HMGB1-RAGE z komórką, sklonowaliśmy cDNA kodujący HMGB1 do pMAL-c2X (New England Biolabs) w celu wytworzenia rekombinowanego HMGB1- Białko fuzyjne MBP. W skrócie, komórki transfekowane RAGE (COS-7) lub próbki transfekowane próbkami inkubowano przez 30 minut w 37 ° C w DMEM z białkiem fuzyjnym HMGB1-MBP w podanych warunkach (Figura 1E), a następnie przemyto w PBS i utrwalono w formaldehydzie (4%). Związany HMGB1-MBP związany z powierzchnią komórki oznaczono ilościowo stosując przeciwciało do znacznika MBP (Roche Diagnostics). Analiza SPR. Badania wiązania przeprowadzono za pomocą SPR z użyciem BIAcore, jak opisano wcześniej (40). W skrócie, HMGB1 unieruchomiono na chipach czujnika CM-5 (BIAcore; Amersham Biosciences), stosując metodę N-etylo-N3- (dimetyloaminopropylo) karbodiimidu / N-hydroksysukcynimidu zgodnie z protokołem sprzęgania aminy zalecanym przez producenta. Do analizy asocjacji seryjne rozcieńczenia peptydów pochodzących z TM lub sRAGE w buforze HBS (10 mM buforze HEPES zawierającym 0,15 M NaCl, 0,005% środka powierzchniowo czynnego P20 i 3 mM EDTA, pH 7,4) wstrzyknięto na czip czujnikowy w 20 ° C i szybkość przepływu 20 l / min. Powierzchnię płytki sensorowej regenerowano przez wymywanie 0,2 M buforem glicyna-HCl, pH 2,7. Sensorgramy analizowano w celu określenia stałych kinetycznych (Ka i Kd) przez dopasowanie danych zgodnie z modelem dysocjacji / asocjacji Langmuira 1: przy użyciu oprogramowania BIAevaluation 3.2. Zgłoszone wyniki są przybliżonymi pozornymi wartościami Kd odzwierciedlającymi stosunek obserwowanych. i wyłącz. stawki. Ocena aktywacji NF-kB i cytokin. Transkrypcję zależną od NF-kB2 monitorowano za pomocą testu genu reporterowego (41). W skrócie, komórki transfekowano konstruktem reporterowym specyficznym dla NF-kBy, zawierającym element reagujący 3X NF-kB (stabilny termicznie sekretarz alkalicznej fosfatazy [SEAP], laboratorium Clontech). Po transfekcji i późniejszej inkubacji we wskazanych warunkach (Figura 2A) przez 16 godzin, zmierzono aktywność enzymatyczną SEAP. Poziomy cytokin badano za pomocą zestawu ELISA specyficznego dla cytokin dla TNF-a. (R & D Systems Inc). Monitorowanie generowania zwrotu z inwestycji. Wytwarzanie ROI oceniano przez inkubację komórek przez 30 minut we wskazanych warunkach (Figura 2B) z DCF-DA (5. M) i tworzenie fluorescencyjnego adduktu dichlorofluoresceiny (DCF) mierzono za pomocą analizy FACS (Beckman- Coulter) lub przy użyciu fluorescencyjnego czytnika mikropłytek (Fluoroscan, BD Biosciences. Pharmacia). Modele zapalenia skóry i LPS. Grzbietowe powierzchnie niepohamowanych myszy BALB / c lub myszy pozbawionych RAGE poddano promieniowaniu UV (długość fali, 254 nm) w dawce 1000 J / m2, stosując lampę UV Crosslinker (Amersham Biosciences). Należy zauważyć, że kontrole dla eksperymentów z myszami z zerowym poziomem RAGE (F7 w C57BL / 6) wykorzystywały zwierzęta C57BL / 6. Aby ocenić stopień zapalenia skóry, zmierzono grubość skóry uszu za pomocą mikrometru scyntylacyjnego (27). W analizie histologicznej próbki ucha utrwalono w formalinie i wybarwiono H & E. Infiltrację leukocytów oceniono półilościowo przez zliczenie liczby jąder w polu dużej mocy (HPF, co najmniej 20 HPF na próbkę analizowano i badano 8 myszy na warunki doświadczalne). Rozmiar uszkodzenia tkanki oceniano za pomocą testu TUNEL. Pokrótce, wolne końce 3 (3-OH DNA fragmentów DNA znakowano nukleotydem skoniugowanym z digoksygeniną. Wyznakowane digoksygeniną fragmenty DNA wykryto przy użyciu znakowanej biotyną anty-digoksygeniny. Niektóre próbki uch były homogenizowane i ekstrahowane w 10 mM buforze HEPES / 10 mM KCl, pH 7,9, z 0,08% NP-40, 0,1 mM EDTA, mM EGTA, 0,5 mM DTT i 0,5 mM PMSF. Mieszaniny wirowano przy 1000 g przez 20 minut w 4 ° C. Otrzymaną frakcję rozpuszczalną uważano za pochodzącą z białka pozukleranowego (tj. Materiału cytozolowego lub uwolnionego z komórek) i badano pod kątem HMGB1 i TNF-a.
[przypisy: karma dla owczarka niemieckiego, zielnik hodowcy, olej kokosowy wybielanie zębów ]
[podobne: uporczywy kaszel przyczyny, magnetyczny rezonans jądrowy, karma dla owczarka niemieckiego ]