Skip to content

N-końcowa domena trombomoduliny maskuje białko grupy B1 o wysokiej ruchliwości, nowy mechanizm przeciwzapalny ad 7

3 tygodnie ago

706 words

Chociaż inne właściwości ochronne mogą być również potencjalne w tej części TM, powiązania między ochronnym działaniem anty-HMGB1 i peptydu pochodnego D1 sugerują, że oddziaływanie TM-HMGB1 może być istotne dla odpowiedzi zapalnej in vivo. Nasze wyniki przesuwają pole do przodu, demonstrując nowy mechanizm przeciwzapalny, sekwestrację HMGB1 przez TM i sugerując potencjalne środki do wykorzystania tej obserwacji w opracowaniu środka terapeutycznego opartego na D1. Metody Komórki i hodowla komórkowa. Ludzkie białaczki THP-1 otrzymano z American Type Culture Collection. Ludzkie fagocyty jednojądrzaste krwi obwodowej zebrano przez wirowanie różnicowe i przyleganie (populację komórek jednojądrzastych) z ludzkiej krwi (21). Ludzkie komórki śródbłonka pępowiny (HUVEC) hodowano z pępowiny zgodnie z ustalonymi metodami (3). Wszystkie procedury z udziałem materiałów ludzkich zostały przeprowadzone pod auspicjami protokołu zatwierdzonego przez instytucyjną komisję rewizyjną szpitala Aiiku i Uniwersytetu Kagoshima w Kagoshima w Japonii. Komórki THP-1 i HUVEC hodowano w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej 10% FCS, penicyliną (100 U / ml) i siarczanem streptomycyny (100 ug / ml). Linię komórkową COS-7 pochodzącą z małpiej nerki utrzymywano w DMEM uzupełnionej tymi samymi dodatkami opisanymi powyżej. W celu wytworzenia komórek z nadekspresją RAGE, cDNA kodujący RAGE o pełnej długości sklonowano do wektora pCI-neo, a następnie konstrukt cDNA transfekowano do komórek COS-7 (35). Stabilne transfektanty wybrano w DMEM uzupełnionym G418 (750 .g / ml). Ekspresję RAGE w transfekowanych komórkach COS-7 scharakteryzowano za pomocą immunoblottingu (dla całkowitej ekspresji RAGE) i immunofluorescencji fluorescencyjnej na niepolarnych komórkach (dla ekspresji RAGE na powierzchni komórki) przy użyciu poliklonalnej anty-RAGE IgG (35). W celu określenia ekspresji RAGE, monowarstwę COS-7 utrwalono formaldehydem (4%) i poddano reakcji z. IgG anty-RAGE, a następnie zmierzono ilość związanego IgG na powierzchni komórki przy użyciu drugiego przeciwciała skoniugowanego z FITC. Myszy. Samice myszy BALB / C i myszy C57BL / 6 (8. 10 tygodni, zakupione z japońskiego SLC) przechowywano w obiekcie wolnym od patogenów w Animal Resource Center na uniwersytecie Kagoshima. Myszy RAGE-zerowe, krzyżowane wstecznie ze szczepem C57BL / 6 (F7), zostały dostarczone przez Hiroshi Yamamoto (Kanazawa University, Kanazawa, Japonia). Eksperymenty z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee z Uniwersytetu Kagoshima w Kagoshima w Japonii i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi NIH. Anti-HMGB1 IgY neutralizujący HMGB1. W celu wytworzenia monoswoistego przeciwciała anty-HMGB1, wyizolowano przeciwciało klasy IgY z żółtka jaja u kur immunizowanych HMGB1 i oczyszczono zgodnie z metodą Hassl i Aspock (36). Testy do interakcji TM-HMGB1. W celu immunoprecypitacji, rhs-TM, przygotowany jak opisano (5, 6, 37) i oczyszczony ludzki HMGB1 (18, 38) (10 nM, w każdym przypadku) inkubowano przez godzinę w 37 ° C w buforze do immunoprecypitacji (20 mM). Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% NP-40, mM PMSF i 0,1% BSA, końcowa objętość, ml). Następnie, perełki agarozowe z białkiem A sprzężone z poliklonalnym anty-HMGB1 (w przybliżeniu 10 .g IgG zaadsorbowano na 20 .l roztworu agarozowego białka A) dodano do mieszanin białek (200 .l każdy) i próbki inkubowano przez dodatkowe godzina. Agarozę białkową A zebrano przez odwirowanie i osadu immunologicznego solubilizowano w buforze do próbek redukującym SDS-PAGE (2% SDS, 50 .l). Próbki (10 .l / ścieżkę) poddano zmniejszonej SDS-PAGE (10%), a następnie przeprowadzono immunoblotting z monoklonalną anty-HMGB1 IgG (BD Biosciences. Pharmingen). Miejsca wiązania pierwotnego przeciwciała wizualizowano za pomocą drugiego przeciwciała skoniugowanego z HRP. W celu określenia zdolności TM do hamowania wiązania RAGE z HMGB1, opracowano następujący test rozwijania. SRAGE-His został przygotowany w sposób opisany wcześniej (23, 39). Pokrótce, cDNA kodujący zewnątrzkomórkową domenę RAGE sklonowano do wektora pQE (Qiagen Inc.). Z kolumną z żywicą niklową rekombinowane sRAGE znakowane histydyną oczyszczono z ekstraktu Escherichia coli transformowanego wektorem. HMGB1 i SRAGE-His (10 nM w każdym przypadku) inkubowano przez godzinę w 37 ° C w PBS (200 .l na próbkę) zawierającym 0,1% BSA. Następnie dodano kulki żywicy niklowej (20 ul) w celu wytrącenia sRAGE-His, żywicę zebrano przez odwirowanie, a osady immunologiczne solubilizowano w buforze do próbek redukującym SDS-PAGE (2% SDS, 50 ul). Próbki (10 ul / ścieżkę) poddano zmniejszonej SDS-PAGE (10%), a następnie przeprowadzono immunoblotting z IgG anty-HMGB1 (0,2 ug / ml)
[hasła pokrewne: zerwanie więzadła krzyżowego przedniego, karmienie gołębi pocztowych, ziarno prawdy online cda ]
[patrz też: ziarno prawdy online cda, olej kokosowy wybielanie zębów, dieta po operacji ginekologicznej ]