Skip to content

Krytyczna rola białka wiążącego chemokiny o wysokim powinowactwie w zapaleniu opon mózgowo-rdzeniowych wywołanym przez | 3-herpes czesc 4

2 tygodnie ago

773 words

Próbki następnie przetwarzano zgodnie z protokołem producenta. Dwadzieścia miligramów całkowitego RNA od każdej myszy poddano następnie obróbce przy użyciu systemu do testowania RNase RibeQuant Multi-Probe (PharMingen, San Diego, California, USA), przy użyciu zestawu szablonów wielu sond mCK-5 zgodnie z protokołem producenta. Analiza reaktywacji ograniczająca rozcieńczenie ex vivo. Częstotliwość komórek zdolnych do reaktywacji z opóźnieniem określono przez test reaktywacji ex vivo ograniczającego rozcieńczenia, jak opisano wcześniej (15, 17, 20, 22, 23). Komórki z przerwami mechanicznymi zawierały mniej niż 1% żywych komórek, a zatem obecność preformowanego wirusa można było stwierdzić na podstawie reaktywacji wirusa z opóźnienia, jak opisano wcześniej (15, 17, 20, 22, 23). Ograniczający rozcieńczenie PCR dla wirusowych komórek genomowych. W celu wykrycia komórek wysięku otrzewnej i splenocytów niosących gen ß HV68 przeprowadzono test PCR z zagęszczeniem z ograniczonym rozcieńczeniem, jak opisano wcześniej (15, 17, 20, 22, 23). W danych w tym raporcie nie było wyników fałszywie dodatnich, a wszystkie testy wykazały około jednej wrażliwości kopii na reakcję PCR dla plazmidowego DNA. Analiza statystyczna. Wszystkie dane analizowano przy użyciu programu GraphPad Prism (GraphPad Software for Science Inc., San Diego, Kalifornia, USA), jak opisano wcześniej (15, 20). Dane dotyczące miana, dane zjadliwości i liczby różnicowe porównywano, stosując sparowany test t. Częstotliwości reaktywacji i komórek genom-dodatnich analizowano za pomocą sparowanego testu t. Częstotliwości reaktywacji i komórek pozytywnych pod względem genomu uzyskano z liczby komórek, przy których 63% studzienek uzyskało wynik pozytywny pod względem zarówno wirusowego efektu cytopatycznego, jak i obecności genomu wirusa na podstawie rozkładu Poissona. Dane poddano nieliniowej analizie regresji w celu uzyskania częstotliwości pojedynczej komórki dla każdej analizy rozcieńczenia ograniczającego. Wyniki Celowe zakłócenie otwartej ramki odczytu M3. Zakłóciliśmy otwartą ramkę odczytu (ORF) M3 przez wstawienie zatrzymania translacji z towarzyszącą mutacją ramki odczytu do miejsca AccI przy współrzędnej genowej 7176 (18) (wirusy AHV68-M3.stop, Figura 1a). To miejsce ma 34 aminokwasy w 406 aminokwasach ORF, ale znajduje się poniżej końca peptydu sygnału sekrecyjnego, tak że skrócone wersje białka potencjalnie wytworzone przez inicjację translacji w dół nie powinny być wydzielane z komórki. Figura Konstrukcja i weryfikacja wirusów A HV68-M3.stop i AHV68-M3.MR. (a) Struktura genowa AHV68, AHV68-M3.stop i AHV68-M3.MR w obszarze ORF M3. (b) Analiza Southern błot AHV68, AHV68-M3.stop i AHV68-M3.MR. Wirusowy DNA oczyszczono ze szczepów wirusa, strawiono Avrll i analizowano za pomocą sondy obejmującej ORF M3 (patrz a). Podano wielkości pasm hybrydyzujących. (c) Analiza Western błot AHV68, AHV68-M3.stop i AHV68-M3.MR. Całkowity komórkowy lizat analizowano za pomocą poliklonalnego Ab do białka M3 lub mAb na p-aktynę. (d) Analiza RT-PCR w czasie rzeczywistym genów M2 i M4 w komórkach NIH 3T12, zakażonych mechanicznie albo HV68 typu dzikiego, AHV68-M3.stop, albo AHV68-M3.MR. Transkrypcję Gene 6 analizowano równolegle jako kontrolę. Pokazane są wredne. SEM połączonych danych z co najmniej trzech niezależnych eksperymentów. NS, brak statystycznie istotnej różnicy między poziomami transkryptu w komórkach zakażonych AHV68-M3.stop w porównaniu z komórkami zakażonymi albo AHV68 lub AHV68-M3.MR. Oczyszczanie AHV68-M3.stop dostarczyło homogenny materiał podstawowy, jak określono przez obecność wstawionej sekwencji zatrzymującej w 50 z 50 łysinek (jak określono za pomocą analizy PCR), brak wykrywalnego białka M3 w 50 z 50 łysinek (jako określona za pomocą ELISA) i odpowiednie schematy trawienia w analizie Southern 20 z 20 łysinek (dane nie przedstawione). Analiza Southern AHV68-M3.stop za pomocą trawienia restrykcyjnego Avrll, przy użyciu znakowanej 32P sondy regionu M3 (bp 5362. 7893), wykazano, zgodnie z przewidywaniem, dodanie dodatkowego miejsca AvrII w obrębie ORF M3 (Figura 1b) . Analiza Western komórek NIH 3T12 zakażonych wirusem AHV68-M3.stop wykazała, że nie można wykryć pełnej długości białka M3 lub skróconych produktów (dane nie przedstawione), z poliklonalnym Ab do białka M3 (Figura 1c). Mutacja M3 stop leży 1,233 bp od przewidywanego początku translacji sąsiedniego genu M4 i 2 548 bp ze znanego miejsca startu transkrypcji sąsiedniego genu M2, co czyni nieprawdopodobieństwo, że wstawienie mutacji M3 zmieni transkrypcję M2 lub M4 ( 24, 25). Aby określić, czy mutacja M3.stop zmieniła transkrypcję M2 lub M4, przeprowadziliśmy analizę RT-PCR w czasie rzeczywistym poziomów transkryptu w fibroblastach NIH 3T12 zakażonych dzikim szczepem typu. HV688,. HV68-M3.stop lub. HV68-M3. .PAN
[patrz też: zerwanie więzadła krzyżowego przedniego, jak dobrze wypaść na rozmowie o pracę, karma dla owczarka niemieckiego ]
[podobne: lotowanie gołębiami młodymi, pzhgp nowa sól, szpital na traugutta wrocław ]