Skip to content

Krytyczna rola białka wiążącego chemokiny o wysokim powinowactwie w zapaleniu opon mózgowo-rdzeniowych wywołanym przez | 3-herpes ad

2 tygodnie ago

718 words

Podaje się tutaj, że białko M3 odgrywa kluczową rolę w ostrym wirusowym zapaleniu opon mózgowych, ale nie odgrywa roli w przewlekłym zapaleniu naczyń ani w ustanawianiu lub reaktywacji z opóźnieniem. Metody Wirusy i kultura tkankowa. . HV68 WUMS (ATCC VR1465) zastosowano do wszystkich infekcji i oznaczono jako HV68 typu dzikiego. . HV68 pasażowano na komórkach NIH 3T12 w celu amplifikacji i rozmnażano jak opisano wcześniej (17). Komórki NIH 3T12 i mysie zarodkowe fibroblasty (MEF) utrzymywano w DMEM, uzupełnionej 10% FCS, 100 U / ml penicyliny, 100 U / ml streptomycyny i 2 mM L-glutaminy (kompletny DMEM). Komórki utrzymywano w inkubatorze do hodowli tkankowej o 5% CO2 w 37 ° C. MEF otrzymano z mysich zarodków BALB / c lub C57BL / 6 jak opisano poprzednio (17). Generowanie mutantów wirusa. Wirus A HV68-M3.stop został wygenerowany przez kotransfekcję lipofektaminy genomowego DNA AHV68 (18) z plazmidem nakierowanym na geny. Macierzysty wektor kierujący, M3-64, zawiera fragment genomu AHV68 z miejsca SpeI przy koordynacie genomu 4632 do miejsca Stul przy 8242 wstawionym do wektora klonującego Litmus 28. Generowany wektor kierujący. HV68-M3.stop został wygenerowany przez wstawienie sekwencji łącznika do miejsca AccI w pozycji 7176. Łącznik zatrzymujący utworzono przez hybrydyzację następujących oligonukleotydów: 5a-CTACCTAGGACTAAGT-3. i 5. -AGACTTAGTCCTAGGT-3 .. Ten łącznik wprowadza trzy kodonowe translacyjne zatrzymania w ramce, mutację zmiany ramki odczytu i nowe miejsce AvrII. Wirus zebrano 6 dni po transfekcji, rozcieńczono, wysiano na monowarstwy NIH 3T12 i po godzinie infekcji nałożono metylocelulozę (2% metyloceluloza w DMEM uzupełnioną 5% FCS, antybiotykami i L-glutaminą), jak opisano wcześniej (15 ). Sto płytek zebrano z każdej transfekcji i ponownie zawieszono w 0,5 ml kompletnej DMEM. Pięć mikrolitrów zawieszonej ponownie łysinki poddano trawieniu proteinazą K przez noc, a następnie analizowano za pomocą zagnieżdżonego PCR specyficznego dla zmodyfikowanej mutacji (zewnętrzne startery: 5a -AGAGGGGAATGGCAATCTGCCTGTT-3a, 5a-GCATATTTAAGGAGGGTCTCCCTGC-3a; CCTTCCTATCCACATCTGTGCTCAT-3a, 5a-AAGAGTGG-GTAGACTTAGTCCTAGG-3.). Pozytywne rekombinanty wykryto z częstotliwością około 4% w pierwszej rundzie oczyszczania łysinek. Płytki zawierające zmutowany wirus oczyszczano w płytce do uzyskania homogeniczności (trzy rundy). Małe zapasy wirusa przygotowano do analizy DNA jak opisano wcześniej (15). Aby ocenić obecność zmutowanej mutacji, przeprowadzono analizę Southern z diagnostycznym fragmentem trawienia AvrII i sondą regionu M3 znakowanego 32P (pz 5362. 7893 z WUMS. HV68). Duże zapasy wirusów wytworzono jak opisano poprzednio (15), a miana zostały niezależnie określone przez test łysinkowy trzy razy. Analizę Western blot przeprowadzono jak opisano wcześniej (16). Wirus z markerem ratunkowym M3 wytworzono przez kotransfekcję macierzystego plazmidu zawierającego M3 (M3-64) genem wirusowym pochodzącym z roztworu wirusa A HV68-M3.stop i oczyszczanie łysinek jak powyżej, z wyjątkiem tego, że rekombinowane płytki zostały teraz zidentyfikowane. przez ocenę obecności wydzielanego białka M3 za pomocą testu ELISA. Sto mikrolitrów zawieszonej ponownie płytki dodano do monowarstwy NIH 3T12 w 96-studzienkowych płytkach i inkubowano w 37 ° C przez 6 dni, w którym to momencie wystąpił znaczący wirusowy efekt cytopatyczny. Supernatanty z tych zainfekowanych monowarstw stosowano do powlekania płytki ELISA Immulon II (Thermo Labsystems, Franklin, Massachusetts, USA) przez noc w 4 ° C. Test ELISA przeprowadzono z króliczymi surowicami odpornościowymi hodowanymi przeciwko bakteryjnie eksprymowanym białkom M3 (8) i rozwinięto ze sprzężonym z peroksydazą chrzanową wtórnym Ab specyficznym względem immunoglobiny królika. Test ELISA był zdolny do wykrywania białka M3 w rozcieńczeniu 1: 106 supernatantów zakażonych ponownie zawieszoną płytką typu dzikiego. Rekombinowane wirusy wykryto z częstotliwością około 4% w pierwszej rundzie oczyszczania. Generowanie wirusa. HV68-M2.stop opisano w innym miejscu (19). Wielopunktowa analiza wzrostu in vitro zmutowanych i dzikich wirusów HV68. Komórki NIH 3T12 infekowano albo wirusami AHV68-M3.stop albo wirusami typu dzikiego HV68 w moi 0,05 w sześcio-studzienkowych płytkach w celu zmierzenia wielokrotnych cykli replikacji wirusa. Całkowite zainfekowane lizaty komórkowe zebrano po 12, 24, 48, 72 i 96 godzinach po infekcji, jak opisano wcześniej (15, 20). Analiza RT-PCR w czasie rzeczywistym zmutowanych i dzikich wirusów HV68. Wpływ mutacji M3 na transkrypcję sąsiadujących genów M2 i M4 określono za pomocą analizy PCR w czasie rzeczywistym. Transkrypty z genu 6, kodujące jednołańcuchowe białko wiążące DNA, określono ilościowo jako wewnętrzną kontrolę odzyskiwania wirusowego RNA
[więcej w: nie radzę sobie z emocjami, lotowanie gołębiami młodymi, karma dla owczarka niemieckiego ]
[więcej w: enrobioflox 10, zielnik hodowcy, karmienie gołębi pocztowych ]