Skip to content

Hepatotoksyczność indukowana acetaminofenem u myszy zależy od Tlr9 i Nalp3 inflammasome ad 8

2 tygodnie ago

735 words

Aspiryna (Sigma-Aldrich) była świeża dla każdego eksperymentu. Aby dawkować przed APAP, aspirynę rozpuszczono w pojedynczej dejonizowanej wodzie o stężeniu 60 mg / l i ogrzewano do 42 ° C z szybkim mieszaniem w celu rozpuszczenia, a następnie szybko umieszczono w łaźni lodowej do ochłodzenia. Aspiryna w wodzie była podawana myszom 60. 72 godziny przed wstrzyknięciem APAP. Zakładając, że zużycie wody wynosi 3. 5 ml dziennie, dawka ta byłaby odpowiednikiem dawki 300. 500 mg u dorosłego człowieka o masie ciała 80 kg. W celu jednoczesnego podania APAP i aspiryny aspirynę podawano w dawce 6 mg / kg w objętości 100 .l wody bezpośrednio po wstrzyknięciu ip APAP. Klopidogrel (Gilead) rozpuszczono w PBS w dawce 6 mg / ml i podawano przez zgłębnik 100 .l, 30 mg / kg, co 24 godziny, rozpoczynając 48 godzin przed i kończąc 24 godziny po wstrzyknięciu APAP. Inhibitor COX-1 (SC-560; Cayman Chemical) rozpuszczono w 50 mg / ml w DMSO i dalej rozpuszczono w PBS w celu zgłębenia dawki 5 mg / kg w 100 .l. Lek podawano dwa razy na dobę, począwszy od 60 godzin przed APAP, i kontynuowano przez 48 godzin po wstrzyknięciu APAP, jak ustalono poprzednio (44). Zapalenie otrzewnej kwasu moczowego. Zapalenie otrzewnej wywołano kryształami kwasu moczowego, jak opisano wcześniej wstrzykując 3 mg MSU ip na mysz (27). Trzy godziny po wstrzyknięciu przeprowadzono płukanie otrzewnej u myszy poddanych eutanazji przez inhalację izofluranem. Infiltrację neutrofili oceniano za pomocą cytometrii przepływowej. Procent komórek Gr-1 (dodatnich (BD Biosciences. Pharmingen) pomnożono przez całkowitą liczbę komórek. Izolacja LSEC. Po trawieniu pronazą in situ, zawiesinę komórek niepłaskochodowych odwirowano przez 5 minut w 100 g w celu usunięcia większości komórek miąższowych. Proces ten powtarzano, dopóki nie zaobserwowano żadnego grudki. Supernatant, wzbogacony w LSEC, wirowano przez 10 minut przy 350 g. Osad ponownie zawieszono w PBS i odwirowywano przez 10 minut przy 350 g. Komórki ponownie zawieszono w PBS i warstwowe (3,3 ml) na szczycie dwuetapowego gradientu Percoll (5 ml 50% Percoll na dnie i 6,6 ml 25% Percoll na górze). Gradienty odwirowano przy 900 g przez 20 minut, a warstwę pośrednią, w tym LSEC, zebrano i hodowano w pożywce (EGM-2 MV, Microvascular Celi Medium Cell-2, cc-4147, Lonza). ODN2088 i IRS 954 wtrysk. Antagonistę Tlr9 (ODN2088, 50. G x 2,) (Invivogen) lub PBS wstrzyknięto ip myszom Tlr9 + / + bezpośrednio po i po 6 godzinach po wstrzyknięciu APAP, a całkowitą mysią wątrobę uzyskano 12 godzin po wstrzyknięciu APAP w ilościowym teście. Q-PCR dla IL-1 .. Antagonista Tlr9 IRS 954 został dostarczony przez AF Barrat (Dynavax Technologies). IRS 954 wstrzyknięto ip w dawce 150 .g na mysz bezpośrednio po APAP i po 14 i 28 godzinach. Apoptotyczne wstrzyknięcie do żyły wrotnej DNA. DNA ze zdrowych i apoptotycznych hepatocytów (200 .g) izolowano przy użyciu zestawu QIAGEN DNeasy Tissue Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Hepatocyty hodowano w 15 mm szalkach i gdy były bliskie konfluencji, eksponowano na promieniowanie ultrafioletowe 600 mJ stosując Stratalinker UV 1800 (Stratagene). Apoptoza komórek była widoczna 6 godzin po napromieniowaniu w typowych zmianach morfologicznych. W tym czasie DNA ekstrahowano i prowadzono na standardowym żelu barwionym bromkiem etydyny, aby potwierdzić degradację DNA zgodną z apoptozą. DNA wstrzyknięto przez żyłę wrotną w typie dzikim i Tlr9a /. myszy. Po 12 godzinach otrzymano całkowitą mysią wątrobę dla histologii i Q-PCR dla IL-1 (3. i IL-18. LSEC. Główne myszy LSEC z Tlr9 + / + i Tlr9. /. myszy hodowano w obecności apoptotycznego DNA (50 .g / ml) lub apoptotycznego DNA plus antagonistę Tlr9 (ODN2088; Invivogen). Dwadzieścia cztery godziny po hodowli przygotowano komplementarny DNA. Q-PCR. Przeprowadzono Q-PCR dla IL-1 (3). i IL-18 przy użyciu komercyjnych zestawów primer-sonda (Applied Biosystems Inc.) i systemu PCR w czasie rzeczywistym Applied Biosystems 7500. Ekspresję GAPDH zastosowano do standaryzacji próbek, a wyniki wyrażono jako stosunek w stosunku do nietraktowanych HSC. Przeprowadzono ilościową PCR w czasie rzeczywistym w celu ekspresji mRNA IL-18, IL-1 p, TNF-a i IFN-y. Całkowitą mysią wątrobę uzyskano 12 godzin po wstrzyknięciu APAP i przygotowano cDNA. Q-PCR przeprowadzono dla IL-18 i IL-1 p przy użyciu komercyjnych zestawów primer-sonda (Applied Biosystems Inc.) i systemu PCR w czasie rzeczywistym Applied Biosystems 7500. Ekspresję GAPDH zastosowano do standaryzacji próbek, a wyniki wyrażono jako stosunek w stosunku do kontroli. Analiza Western blot. Analiza Western błot kaspazy-1 przeprowadzona zgodnie ze standardowymi protokołami z użyciem lizatu komórkowego z 2 x 105 LSEC i przeciwciała anty-kaspazy-1 (Santa Cruz Biotechnology Inc.)
[więcej w: pzhgp nowa sól, uporczywy kaszel przyczyny, olej kokosowy wybielanie zębów ]
[patrz też: amc esk, gołębniki świata, enrobioflox 10 ]