Skip to content

Hamowanie mTORC1 prowadzi do aktywacji szlaku MAPK przez zależną od PI3K pętlę sprzężenia zwrotnego w ludzkim raku czesc 4

4 tygodnie ago

634 words

Aby ocenić możliwą rolę PDGFR w indukcji p-ERK, przeanalizowaliśmy ekspresję tych receptorów w liniach komórkowych raka sutka stosowanych w tym badaniu. PDGFRB znajdował się poniżej poziomu wykrywania za pomocą analizy Western blot, podczas gdy PDGFRA wykryto tylko w komórkach BT549 (dodatkowa Figura 3A). Nie zaobserwowaliśmy różnic w ekspresji PDGFRA po traktowaniu rapamycyną tą linią komórkową (Suplementowa Figura 3B). Dane te sugerują, że przynajmniej w tym modelu układu indukcja PDGFR prawdopodobnie nie wyjaśni aktywacji MAPK przez rapamycynę. Następnie zbadaliśmy rolę dobrze znanej pętli sprzężenia zwrotnego za pośrednictwem S6K (16). Nadekspresja niezrażliwej mTOR i konstytutywnie aktywnej postaci S6K1 (HAS6K1 E389 D3A) była w stanie zmniejszyć aktywację ERK pośredniczoną przez rapamycynę (Figura 5A), co sugeruje, że S6K1, co do którego wykazano, że sprzeciwia się sygnalizacji IRS-1 (15), jest zaangażowany w aktywację MAPK przez rapamycynę. Zgodnie z tym stwierdzeniem stwierdziliśmy, że rapamycyna współpracowała ze związkami aktywującymi IRS-1 (3 (IGF-1 i insulina) w celu suplementacji MAPK (Figura 5B). Co więcej, ponowne wprowadzenie Tsc2 do komórek Tsc2-null zwiększyło fosforylację ERK, wzmacniając pogląd, że szlak MAPK znajduje się pod negatywną regulacją przez mTORC1 (Figura 5C). Następnie farmakologicznie zahamowaliśmy PI3K, aby sprawdzić jego rolę w sygnalizacji rapamycyny dla MAPK. Hamowanie PI3K przez LY294002 zmniejszało aktywację ERK za pośrednictwem rapamycyny (Figura 5D). Ponadto, w kontekście aktywacji MAPK przez insulinę, preinkubacja z nieodwracalnym inhibitorem PI3K (wortmanina) była w stanie zmniejszyć wywołaną rapamycyną aktywację ERK, wskazując w ten sposób na zaangażowanie PI3K w aktywację MAPK zależną od insuliny (Figura 5E). Podsumowując, nasze wyniki definiują nową pętlę sprzężenia zwrotnego za pośrednictwem mediatora S6K-1-PI3K3, której kulminacją jest ujemna regulacja MAPK. Figura 5: Aktywacja MAPK indukowana rapamycyną jest następująca po S6K / IRS-1 / PI3K. (A) fosforylacja ERK w MCF7 transfekowanym przez 24 godziny S6K1 typu dzikiego (HAS6K1wt) lub konstytutywnie aktywną formą S6K1 niewrażliwą na rapamycynę (HAS6K1 E389 D3E) i traktowaną rapamycyną (20 nM, 24 h, n = 3). (B) Stan fosforylacji ERK i RpS6 w głodzonych (24 h, 0,1% FBS) komórkach T24 traktowanych nośnikiem lub rapamycyną (20 nM, 24 h) i stymulowanych insuliną (200 nM, 15 min) lub IGF-1 (100 ng) / ml, 15 min; n = 3). (C) Fosforylacja ERK i RpS6 w NFK bez znaku Ts2 pull-null 24 godziny po transfekcji pustym wektorem lub 0,5 lub 4 .g wektora ekspresyjnego Tsc2 (n = 3). Gwiazdka oznacza niespecyficzne pasmo. HSP90 zastosowano jako kontrolę obciążenia. (D) Wpływ rapamycyny (20 nM, 24 godz.) I / lub inhibitora PI3K LY294002 (10 .M, 24 godz.) Na fosforylację AKT, ERK i RpS6 w komórkach MCF7 (n = 3). (E) Fosforylacja AKT, ERK i RpS6 w głodzonych (24 h, 0,1% FBS) komórek MCF7 preinkubowanych z DMSO lub wortmaniną (500 nM, 45 min) i stymulowanych insuliną (100, 200 i 400 nM; 3). Liczby wskazują stosunek fosforylowanego białka w odniesieniu do poziomów białka całkowitego. Farmakologiczne hamowanie MAPK wzmaga działanie przeciwnowotworowe rapamycyny. Identyfikacja indukowanej przez rapamycynę aktywacji MAPK skłoniła nas do osiągnięcia potencjalnej korzyści terapeutycznej z terapii skojarzonej za pomocą MEK1 / 2 (bezpośredni górny aktywator ERK) i inhibitorów mTORC1. Aby zbadać zdolność tych rodzin leków do hamowania wzrostu komórek, potraktowaliśmy komórki pojedynczymi środkami lub kombinacją obu leków i analizowaliśmy wzrost. Podczas gdy zarówno rapamycyna, jak i UO126 spowolniły wzrost komórek, gdy były stosowane jako pojedyncze środki, ich połączenie miało działanie addytywne, powodując prawie całkowite zahamowanie wzrostu (Figura 6A i Suplementacja Figura 4). Co ważne, efekt ten był związany z uchyleniem odpowiedzi sprzężenia zwrotnego (figura 4D i dodatkowa figura 4). Następnie zbadaliśmy mechanizmy, które hamują wzrost w komórkach MCF7 i stwierdziliśmy, że podczas gdy odpowiedzi autofagiczne i apoptotyczne były prawie niewykrywalne i nie różniły się między różnymi terapiami (<1%, suplementowa figura 5), proliferacją komórek (mierzoną przez inkorporację BrdU). ) było znacznie zmniejszone przez leczenie pojedynczym środkiem. Co istotne, połączenie leków doprowadziło do dalszego zmniejszenia odsetka komórek proliferujących (Figura 6B). Figura 6 Blokada farmakologiczna ścieżki MAPK in vitro zwiększa zahamowanie wzrostu za pośrednictwem rapamycyny. (A i B) Wpływ rapamycyny (Rapa; 20 nM), UO126 (10 .M) lub połączenie obu na wzrost komórek (A) i inkorporację BrdU (B, po 24 godzinach traktowania; n = 4). ** P <0,01 w porównaniu z komórkami traktowanymi podłożem; P <0,05 i P> 0,01 w porównaniu z komórkami traktowanymi rapamycyną; $ P <0,05 i $$ P <0,01 w porównaniu z komórkami traktowanymi UO126 [patrz też: jak dobrze wypaść na rozmowie o pracę, zaburzenia afektywne dwubiegunowe, zielnik hodowcy ] [hasła pokrewne: zerwanie więzadła krzyżowego przedniego, testy osobowości psychologia, amc esk ]