Skip to content

Hamowanie mTORC1 prowadzi do aktywacji szlaku MAPK przez zależną od PI3K pętlę sprzężenia zwrotnego w ludzkim raku cd

2 tygodnie ago

198 words

Znakowanie immunologiczne p-ERK u pacjentów z rakiem sutka przed i po leczeniu RAD001. Komórki nowotworowe są oznaczone strzałkami lub okręgami. Oryginalne powiększenie, × 40. (D) Procent pacjentów z aktywacją MAPK po leczeniu RAD001, mierzony fosforylacją ERK, w 2 różnych schematach podawania. RAD001 aktywuje MAPK w mysim modelu raka gruczołu krokowego. Aby potwierdzić dane uzyskane z naszego badania klinicznego, przeanalizowaliśmy odpowiedź szlaku MAPK na codzienne leczenie dużą dawką RAD001 (10 mg / kg / dobę, maksymalna tolerowana dawka) w mysich nowotworach prostaty wynikających z warunkowej inaktywacji Pten. Jak pokazano na Figurze 3, traktowanie RAD001 dało znaczący wzrost fosforylacji ERK w prostatach Pten-zer, w których hamowano mTORC1 (mierzony metodą fosforylacji RpS6, Suplementowa Figura 1, materiały uzupełniające dostępne online z tym artykułem; doi: 10,1172 / JCI34739DS1) . Wyniki te potwierdzają dane uzyskane w badaniu klinicznym z RAD001, dostarczając tym samym dalszych dowodów, że hamowanie mTORC1 prowadzi do aktywacji MAPK in vivo. Figura 3: Traktowanie 3RAD001 prowadzi do aktywacji MAPK u myszy warunkowych prostaty Pten-null. (A) immunobarwienie p-ERK w prostatach myszy Pten-null leczonych nośnikiem lub RAD001 przez 4 tygodnie. Przedstawiono reprezentatywny obszar. n = 3 myszy na grupę. (B) Kwantyfikacja wybarwiania p-ERK w gorących miejscach (obszary wysoko p-ERK). ** P <0,01 w porównaniu z traktowaniem pojazdów. Paski błędów wskazują SD. Aktywacja MAPK przez rapamycynę obejmuje pętlę sprzężenia zwrotnego ujemną względem S6K sygnalizującą szlaki PI3K-Ras. W celu określenia charakteru aktywacji MAPK przez hamowanie mTORC1, sprawdziliśmy istnienie tego obwodu sygnalizacyjnego w panelu komórek w hodowli, w tym pierwotnych mysich fibroblastów zarodkowych (MEF), sutka lub linii komórek raka pęcherza moczowego (Figura 4A). i dodatkowa ilustracja 2). Co ciekawsze, zaobserwowaliśmy, że komórki z nadaktywną sygnalizacją PI3K wykazują zwiększoną aktywację MAPK po podaniu rapamycyny (Figura 4A). Aby przetestować istnienie tego sprzężenia zwrotnego genetycznie, wygenerowaliśmy MEF-y niosące allele mTor z loxP, dla których dostarczanie Cre z zastosowaniem retrowirusów prowadzi do dezaktywacji genetycznej mTor. Uderzająco, delecja mTOR spowodowała aktywację ERK, podczas gdy fosforylacja AKT w Ser473 została zahamowana (Figura 4B) w wyniku ablacji mTORC2 (omówionej w odnośniku 2). Wyniki te wskazują, że utrata funkcji mTOR (czy to poprzez hamowanie farmakologiczne, czy też delecję genetyczną) ma wpływ na status aktywacji MAPK bez konieczności mTORC2, AKT lub celów położonych poniżej AKT. Figura 4Rapamycyna aktywuje Ras-Raf1-MEK-ERK in vitro. (A) Wpływ leczenia rapamycyną (20 nM, 24 godz.) Na fosforylację ERK, AKT i RpS6 (S6) w MEF z różnymi modyfikacjami genetycznymi (n = 3). p-S6, ufosforylowany RpS6. (B) Fosforylacja ERK, AKT i RpS6 u unieśmiertelnionych MEF z SV40 po ostrej delecji genetycznej mTOR. (C) Stan fosforylacji Raf1, ERK i RpS6 w komórkach MCF7 po leczeniu rapamycyną (20 nM, 24 h, n = 3). (D) Wpływ rapamycyny (20 nM, 24 godz.) I / lub inhibitora MEK UO126 (10 uM, 24 godz.) Na fosforylację ERK i RpS6 w komórkach MCF7 (n = 3). (E) fosforylacja ERK i RpS6 w MCF7 transfekowanym przez 24 godziny pustym wektorem (pozorowanym) lub dominującą negatywną postacią Ras (RasN17) i leczoną rapamycyną (20 nM, 24 h, n = 3). Liczby wskazują stosunek fosforylowanego białka w odniesieniu do poziomów białka całkowitego. Następnie staraliśmy się określić mechanizm zależnej od inhibicji mTORC1 aktywacji ERK poprzez badanie jej wcześniejszych regulatorów. Dwie linie dowodów wykazały, że szlak Ras-Raf1 jest niezbędny do aktywacji ERK w wyniku farmakologicznej lub genetycznej inhibicji mTORC1. Najpierw zaobserwowaliśmy, że fosforylacja Ser338-Raf1 indukowana rapamycyną (Figura 4C) i że inhibitor MEK1 / 2 UO126 znosił zależną od rapamycyny aktywację ERK (Figura 4D). Po drugie, ekspresja dominującego negatywnego mutanta Ras (N17) pozwoliła nam potwierdzić, że aktywność Ras jest istotna dla fosforylacji ERK indukowanej rapamycyną (Figura 4E). Wyniki te pokazują, że hamowanie mTORC1 za pośrednictwem rapamycyny obejmuje szlak Ras-Raf1-MEK1 / 2-ERK. Aby zapewnić dalszy mechanistyczny wgląd w aktywację Ras-MAPK, zbadaliśmy ścieżki wcześniej pokazane pod kontrolą mTORC1. Nasze poprzednie wyniki pokazujące aktywację ERK w komórkach z niedoborem mTor (Figura 4B) sugerują, że czynniki poniżej mTORC2, takie jak AKT, TSC1 / 2 lub Rheb, nie są wymagane do aktywacji MAPK przez rapamycynę. [podobne: szpital okulistyczny poznań, olej kokosowy wybielanie zębów, karma dla owczarka niemieckiego ] [przypisy: uporczywy kaszel przyczyny, magnetyczny rezonans jądrowy, karma dla owczarka niemieckiego ]