Skip to content

Hamowanie mTORC1 prowadzi do aktywacji szlaku MAPK przez zależną od PI3K pętlę sprzężenia zwrotnego w ludzkim raku ad 8

1 miesiąc ago

638 words

cDNA uzyskano z Transcriptor (Roche). Sondy TaqMan otrzymano z Applied Biosystems Inc. Amplifikacje przeprowadzono w 7900 systemie PCR w czasie rzeczywistym (Applied Biosystems Inc.). Każdą wartość korygowano stosując poziomy a-glukuronidazy jako odniesienie. Immunohistochemia. Immunohistochemię p-ERK przeprowadzono na utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie odcinkach biopsji guza. Królicze przeciwciało monoklonalne p-ERK (1: 100, IHC Preferred, Cell Signaling Technology Inc.) i p-S6 (Cell Signaling Technology Inc., Katalog 2211) inkubowano po indukowanym ciepłem epitopie pobierania (HIER) z buforem cytrynianowym ( pH 6,0) i wstępną obróbkę parową przez 30 minut. W przypadku immunohistochemii Ki-67, 10 mM cytrynian sodu (pH 8,0) inkubowano przez 10 minut w szybkowarze do odzyskiwania antygenu, a próbki następnie inkubowano z króliczym monoklonalnym przeciwciałem anty-Ki-67 (Lab Vision, 1: 200). następnie drugorzędowe przeciwciało biotynylowane kozie anty-królicze IgG (Jackson ImmunoResearch, 1: 200). Detekcję przeprowadzono za pomocą zestawu substratu peroksydazy DAB (SK-4100, Vector Laboratories), a szkiełka wybarwiono kontrastowo hematoksyliną (Fisher Scientific) i zamontowano w Permount (EMS). W przypadku barwienia TUNEL, po odzyskaniu antygenu (przeprowadzonego jak opisano powyżej), próbki wstępnie traktowano proteinazą K (Sigma-Aldrich). Następnie skrawki inkubowano z terminalną transferazą (TdT, Roche Diagnostics) i biotyną-16-dUTP (Roche Diagnostics). Detekcję przeprowadzono za pomocą koniugatów HRP-streptawidyna (1: 100) i opracowano z zestawem substratu peroksydazy DAB (SK-4100, Vector Laboratories). Na koniec szkiełka wybarwiono kontrastowo hematoksyliną (Fisher Scientific) i osadzono w Permount. Analiza Western blot. Lizaty komórkowe przygotowano z użyciem buforu RIPA, 1% Nonidet P40, 0,5% dezoksycholanu sodu, 0,1% SDS i koktajlu inhibitora proteazy; Roche). Następujące przeciwciała zastosowano do analizy metodą western blot (wszystkie z Cell Signaling Technology, z wyjątkiem wskazanych przypadków): królicze poliklonalne anty-AKT (katalog 9272) i antyAp-Ser473 AKT (nr katalogowy 9271), królicze poliklonalne anty-p2-Ser240 / 244 RpS6. (katalog 2215) i królicze monoklonalne anty-RpS6 (katalog 2217), królicze poliklonalne anty-p42 / p44 MAPK (katalog 9101) i królicze poliklonalne anty-p42 / p44 MAPK (katalog 9102), królicze poliklonalne anty-p-p90RSK (katalog 9341) i królicze monoklonalne anty-RSK1 / 2/3 (katalog 9347), mysie monoklonalne anty-aktyny (Sigma-Aldrich, katalog A5316), mysie monoklonalne anty-HSP90 (BD Biosciences. Pharmingen, katalog 610419), mysie monoklonalne anty-HA (Covance), królicze monoklonalne anty-p-Ser338 Raf1 (katalog 9427), królicze poliklonalne anty-Raf1 (katalog 9422), mysie monoklonalne anty-Ras (BD Biosciences. Pharmingen), mysie monoklonalne anty-PDGFRB ( katalog 3175), mysią monoklonalną antycyklinę B1 (katalog 4135) i królicze monoklonalne anty-PDGFRA (Katalog 3174). Po standardowym SDS-PAGE i procedurach western blotting, białka wizualizowano przy użyciu systemu ECL (Amersham Biosciences) i określano ilościowo za pomocą oprogramowania ImageJ z NIH na komputerach Macintosh. Analiza wzrostu komórek. W celu proliferacji komórek, x 104 komórek raka sutka lub 2 x 104 komórek MEF wysiano w trzech powtórzeniach na 12-studzienkowych płytkach. Dwadzieścia cztery godziny później komórki uważane za dzień 0 utrwalono w formalinie 10%. Tę samą procedurę przeprowadzono w dniach wskazanych na Figurze 6A i Suplementowej Figurze 4. Wzrost komórek mierzono przez barwienie fioletem krystalicznym (0,1% w 20% metanolu) przez 45 minut. Osad solubilizowano w 10% kwasie octowym i zmierzono absorbancję przy 595 nm. Próbki z fazy I badania klinicznego z RAD001. Kryteria wejściowe do fazy I badania klinicznego z RAD001 były takie, że uczestniczący pacjenci mieli zaawansowaną chorobę, która uległa postępowi w standardowych terapiach i że pacjenci mieli guz dostępny do biopsji. Leczenie prowadzono do czasu progresji choroby. Czas biopsji różni się między codziennymi i tygodniowymi harmonogramami (Ryc. 1). W dziennym harmonogramie, próbki tkanek uzyskano w punkcie wyjściowym i przed dawkowaniem w dniu 2 w tygodniu 4. W schemacie tygodniowym, próbki uzyskano w punkcie wyjściowym oraz między dniami 4 i 6 po podaniu dawki w tygodniu 4. Po zabiegu, biopsje przechowywano do czasu analizy w Molecular Oncology Laboratory w Vall d. Hebron University Hospital. Zahamowanie sygnalizacji mTORC1 obserwowano we wszystkich poziomach dawek i schematach dawkowania. Próbki tkanek natychmiast umieszczono w 4 ° C wstępnie ochłodzonym 4% obojętnym buforowanym roztworze formaliny i utrwalano przez 8 do 16 godzin. Stałe próbki poddawano dalszej obróbce przez rutynowe odwodnienie próbki przy użyciu stopniowanego etanolu do ksylenu
[patrz też: apteka hygea zielona góra, olej kokosowy wybielanie zębów, gołębniki świata ]
[hasła pokrewne: apteka hygea zielona góra, zaburzenia afektywne dwubiegunowe, jak dobrze wypaść na rozmowie o pracę ]