Skip to content

Hamowanie mTORC1 prowadzi do aktywacji szlaku MAPK przez zależną od PI3K pętlę sprzężenia zwrotnego w ludzkim raku ad 7

2 tygodnie ago

674 words

Z drugiej strony, inhibitory MEK, takie jak PD0325901 i ARRY-142886 są obecnie testowane w klinice z obiecującymi wynikami (21). Tak więc kombinacja inhibitorów MEK i mTORC1 może okazać się bardzo skuteczna, ponieważ umożliwiłaby hamowanie mTORC1 bez aktywacji sprzężenia zwrotnego MAPK. Zgodnie z tym pomysłem, nasze dane pokazują, że hamowanie MEK1 / 2 wzmaga działanie przeciwnowotworowe rapamycyny in vitro i, co ważniejsze, in vivo. To, czy 2 środki lecznicze oddziałują, aby zahamować proliferację komórek lub wywołać apoptozę (lub oba) wydaje się różnić w zależności od sygnałów różnicowo obecnych in vitro i in vivo. Dalsza analiza zapewni wgląd w molekularny charakter obserwowanych rezultatów zależnych od kontekstu. Ponadto, towarzyszące badanie przeprowadzone przez Kinkade i współpracowników wykazało, że kombinatoryczne stosowanie tej klasy związków wywiera silny efekt przeciwnowotworowy w przedklinicznym mysim modelu raka prostaty (43). Ustalona tu pętla sprzężenia zwrotnego dalej odkrywa złożone szlaki związane z opornością na leki blokujące mTORC1 i dostarcza uzasadnienia dla zastosowania terapii kombinatorycznej z inhibitorami MAPK. Metody Hodowla komórkowa i odczynniki. UO126, LY294002, wortmaninę i rapamycynę zakupiono z Cell Signaling. Insulina i IGF-1 pochodziły z Sigma-Aldrich. RAD001 i PD0325901 były prezentami odpowiednio od Novartis AG i Pfizer. MEF różnych genotypów wytworzono standardowymi procedurami i hodowano w DMEM z 1% glutaminy i 10% FBS. MCF7, MDAMB-435S i MDAMB-468 hodowano w DMEM z 1% glutaminy i 10% FBS. Komórki T24 hodowano w RPMI z 1% glutaminy i 10% FBS. Infekcje retrowirusowe. Pierwotne MEF mTORloks / lox przygotowano jak opisano uprzednio (44) i zakażono retrowirusem eksprymującym Cre-PURO-IRES-GFP i odpowiadającym mu wirusem kontrolnym. Produkcja cząstek wirusa i zakażenie MEF przeprowadzono w sposób opisany uprzednio (45). Analizę Western blot przeprowadzono 24 godziny po selekcji puromycyną. Transfekcje. Komórki MCF7 transfekowano Effectene (Roche) zgodnie ze standardowym protokołem. Do transfekcji ME2 z wartością Tsc2, Lipofectamine 2000 (Invitrogen) zastosowano zgodnie ze standardowymi procedurami. Do naszych badań wykorzystano plazmidy PCDNA3.1, PCDNA3.1-Xpress-Tsc2, pRK7-HAS6K1-E389 D3E, pRK7-HAS6K1wt i pCMV5-HRasN17. Leczenie in vivo RAD001 myszy Pten-null. Post-dojrzewania prostatowo-warunkowego Ptenpc. /. myszy traktowano RAD001 lub odpowiednim nośnikiem. RAD001 podawano przez zgłębnik doustny w dawce 10 mg / kg / dobę przez 4 tygodnie. Komisje ds. Etyki w Centrum Medycznym w Beth Israel w Diakoness i w Memorial Sloan-Kettering Cancer Center zatwierdziły badania na zwierzętach. Sześć heteroprzeszczepów heteroprofilnych in vivo. Komórki MCF7 (6 x 106) przygotowano w 1: 2 podłożu Matrigel HC / Complete i wstrzyknięto do boku samic myszy Nagich, w których umieszczono pastylkę 17.-estradiol (0,72 mg, 60-dniowe uwalnianie, Innovative Research of America). wstępnie wszczepione. Gdy guzy osiągnęły 300 mm3 (średnio 15 dni), myszy przydzielono losowo do różnych grup eksperymentalnych. Leczenie przeprowadzono w schemacie dnia w dniu wolnym od pracy przez 10 dni, a leki podawano z doustnym zgłębnikiem (w 12-godzinnej ramie czasowej między 2 lekami). RAD001 podawano w dawce 10 mg / kg / traktowanie. PD0325901 rozpuszczono w 0,05% (hydroksypropylo) metylocelulozie, 0,02% roztworze Tween-80 w sterylnej wodzie i podawano w dawce 15 mg / kg / traktowanie. Guzy zmierzono za pomocą suwmiarki zewnętrznej i ważono po uśmierceniu myszy i ekstrakcji guza. Test proliferacji. Dwadzieścia cztery godziny po traktowaniu nośnikiem lub rapamycyną komórki MCF7 pulsowano BrdU 5 (ig / ml przez 6 godzin. Barwienie BrdU przeprowadzono zgodnie ze standardowymi procedurami. Pokrótce, komórki utrwalono w 4% PFA i DNA zdenaturowano za pomocą HCl 2N i przemyto boranem sodu. Po permeabilizacji w 0,1% Triton X-100, przeciwciało anty-BrdU (1: 100; BD Biosciences . Pharmingen) inkubowano przez noc, a następnie drugorzędową anty-mysią Alexa Fluor 488. Do kwantyfikacji, 3 pola na stan z minimum 150 komórek każdy zliczono i obliczono procent komórek BrdU-dodatnich. Analiza immunofluorescencyjna. Komórki utrwalono w 4% PFA przez 15 minut i permeabilizowano w 0,1% Triton X-100. W przypadku barwienia TUNEL stosowano zestaw do detekcji komórek (Roche) zgodnie z instrukcjami producenta. Do barwienia autofagicznego zastosowano przeciwciało LC3 (1: 200; Nanotools). Real-time PCR. RNA wyizolowano za pomocą zestawu RNeasy Protect (Qiagen) i włączono etap trawienia DNazy, stosując zestaw DNazy wolny od RNazy (Qiagen)
[patrz też: amc esk, karma dla owczarka niemieckiego, czy można żyć bez trzustki ]
[podobne: szpital na traugutta wrocław, czy można żyć bez trzustki, projekt ustawy o zdrowiu publicznym ]