Skip to content

Dynamiczna dystrybucja kalpainy specyficznej dla mięśni u myszy odgrywa kluczową rolę w adaptacji stresu fizycznego i jest upośledzona w dystrofii mięśniowej cd

2 miesiące ago

54 words

Frakcję Sup z TA poddano analizie Western blot przy użyciu anty-pIS2C Ab (A). Hairline wskazują ścieżki, które były prowadzone na tym samym żelu, ale nie były spójne. Prążki p94 oznaczono ilościowo przez normalizację do aktyny barwionej CBB (CBB w A) (B). cd, ekspresjonowany COS p94: C129S. * P <0,01. (C = N) Uszkodzone mięśniaki w mięśniach brzuchatego łydki z myszy WT, WT-ex, p94KI i p94KI-ex wykryto za pomocą autofluorescencji anty-lamininy a2 (C. F) i EBD (G. J). Scalone obrazy i jądra (K. N). Pręty skali: 100 .m. (O) Drastyczny wzrost poziomu CK w surowicy w p94KI-ex. Próbki krwi WT-ex i p94KI-ex pobierano bezpośrednio po akcyzie. (P i Q) Udział CNM w p94KI był znacząco zwiększony po wysiłku. Analizowano TA (P) i soleus (Q) z WT, p94KI, WT-ex i p94KI-ex uśmiercone 10 dni po ćwiczeniu. Proporcje CNM obliczono jak na ryc. 1. * P <0,05 versus WT; ** P <0,05 versus p94KI; *** P <0,05 versus WT-ex. Mięśnie szkieletowe mają zdolność szybkiego naprawiania się w odpowiedzi na uraz lub chorobę (21). Po wysiłku uszkodzone mięśnie u myszy p94KI zaczęły się regenerować (dodatkowa Figura 4). Przenikanie komórek jednojądrzastych do uszkodzonego mięśnia obserwowano w dniach po treningu 1. 3, a regenerujące cienkie miowłókna obserwowano w dniu 10 po treningu, chociaż te miowłókna były niejednorodne, z pojawieniem się zwyrodnienia dystroficznego. Wyniki te sugerują, że brak aktywności proteolitycznej p94 nie wpływa na potencjał regeneracyjny komórek satelitarnych. Szybkość wymiany p94 w miofibryle jest dobrze dopasowana przez jego aktywność proteazową. Aby zrozumieć mechanizmy molekularne, dzięki którym p94 chroni mięśnie, przeanalizowaliśmy zachowanie wewnątrzkomórkowe p94. Wcześniej wykazaliśmy, że p94 ma rozkład zależny od rozciągnięcia (19) i że wiąże fizycznie i funkcjonalnie białka sarkomeryczne, w tym łącznik / titynę i MARP2 (17). Dlatego porównaliśmy zachowanie dynamiczne p94 w miocytach myszy WT i p94KI przy użyciu odzysku fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP) z WT p94 znakowanym GFP i p94: C129S (GFP-p94WT i GFP-p94CS) wyrażonymi w pierwotnie hodowanych miotubach z WT i p94KI. myszy. Sygnały GFP zarówno dla GFP-p94WT jak i GFP-p94CS wykryto głównie na linii M połączenia / titiny (odnośnik 19 i Figura 3, A i B). Eksperymenty FRAP ujawniły, że białka GFP-p94WT w linii M były dynamicznie mobilne, z odzyskiem t1 / 2 wynoszącym 66,5 s (Figura 3C). Ta szybkość obrotu była prawie tak szybka, jak frakcja ruchoma (3 -actinin fast mobile (t1 / 2 = 61. 11 s) (22). Warto zauważyć, że GFP-p94CS wykazywał znacznie dłuższe odzyskiwanie t1 / 2 (129 s) niż GFP-p94WT (Figura 3C, Dodatkowe Figury 5 i 6). Wyniki te wskazywały, że p94 jest dynamicznie zlokalizowany w ściśle zorganizowanym sarkomerze, a jego ruchliwość jest precyzyjnie dostrajana przez jego aktywność proteazową. Rycina 3 Przeniesienie p94 w odpowiedzi na długość sarcomeryczną. (A (C) Bezpośrednia obserwacja szybkiej wymiany GFP-p94 w hodowanych miotubach metodą FRAP. GFP-p94WT i GFP-p94CS ulegały ekspresji egzogennej w hodowanych myotubach myszy WT (A) i p94KI (B) i były głównie zlokalizowane na liniach M linkiny / titiny. Referencyjne obrazy uzyskano przed fotowybielaniem (Pre). Prostokąty wskazują fotowybielone obszary. Sygnały w linii M zostały obliczone jako stosunek intensywności GFP we wskazanych punktach czasowych i dopasowano krzywe wykładnicze (C). Frakcję ruchomą (M), stałą szybkości (k) i połowę czasu odzyskiwania (t1 / 2) obliczono z krzywej FRAP. Należy zauważyć, że pojedyncze dopasowanie wykładnicze dało najlepszy wynik, a k (tj. T1 / 2) znacząco różniło się między WT i p94KI (patrz dodatkowe rysunki 5 i 6). (D. P) Mikrofotografie konfokalne lokalizacji p94 w podłużnych przekrojach EDL z myszy WT (D. F i J. L) i p94KI (G. I i M. O). p94, prążki Z i region N2A connectin / titina wykrywano anty-pNS (E, H, K i N), anty-s-a-aktyniną (D i G; strzałki) i anty-łączeniem / titin-N2A (J i M, strzałki) Abs, odpowiednio. p94 było zlokalizowane na liniach M (otwarte groty strzałek), regionach N2A i / lub pasmach Z (w nawiasach) obu myszy, ale głównie w regionach N2A w wydłużonych sarkomerów (K i N). Stosunek sygnału p94 w linii M do tego w regionie N2A wykreślono względem długości sarcomerycznej (P). Dwie szacunkowe linie statystycznie okazały się istotnie różne (patrz Dodatkowa legenda z rysunku 6). Paski skali: 10 .m. Aktywność proteazy p94 jest wymagana do dynamicznej redystrybucji w odpowiedzi na obciążenie mechaniczne [hasła pokrewne: testy osobowości psychologia, zaburzenia afektywne dwubiegunowe, magnetyczny rezonans jądrowy ] [hasła pokrewne: uporczywy kaszel przyczyny, magnetyczny rezonans jądrowy, karma dla owczarka niemieckiego ]