Skip to content

Dynamiczna dystrybucja kalpainy specyficznej dla mięśni u myszy odgrywa kluczową rolę w adaptacji stresu fizycznego i jest upośledzona w dystrofii mięśniowej ad 8

2 tygodnie ago

753 words

Aby zapobiec nieswoistemu wzrostowi wartości CK, do analizy ilościowej wykorzystano pobranie jednej próbki krwi na próbkę. Surowicę CK mierzono za pomocą Histologii SRL Inc. i analizy Western blot. Barwienie H & E i znakowanie immunochemiczne przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem (42). Fluorescencję obserwowano na mikroskopie konfokalnym skanującym laser (Zeiss LSM510). Obrazy były manipulowane za pomocą oprogramowania do obrazowania LSM. Liczbę myowłókien i CNM zliczono w sekcjach wybarwionych H & E. CSA miofibrów zmierzono za pomocą oprogramowania AlphaEaseFC Software ver. 3.1.2 (Alpha InnoTech Corp.). Analizę Western blot przeprowadzono jak opisano wcześniej (19). Mięśnie szkieletowe poddano lizie z buforem TED (10 mM Tris / Cl [pH 7,5], mM EDTA, mM DTT). Frakcje Sup i Ppt przygotowano przez odwirowanie przy 23 000 g przez 20 minut. Intensywność prążków znormalizowano do intensywności barwionej CBB aktyny lub prążka Mhc. Pierwotne Abs użyte w tym badaniu wymieniono w Tabeli dodatkowej 2. Kwantyfikacja sygnału p94 w sarkomerów. Po barwieniu za pomocą anty-pNS Ab, który wykrywa p94 (43), średnie natężenia sygnału p94 w strefach M i N2A zostały określone ilościowo za pomocą Photoshop CS2 (Adobe). Stosunek sygnału p94 w pojedynczym sarcomere obliczono jako stosunek gęstości sygnału p94 w M do gęstości sygnału p94 w N2A. Każdą wartość wykreślono na wykresie rozproszenia w odniesieniu do długości sarcomerycznej, którą mierzono jako odległość między środkami sąsiednich linii Z-s-aktyniny-dodatnich linii Z za pomocą oprogramowania do obrazowania LSM. Całkowita liczba sarkomerów wynosiła 195 dla WT i 188 dla p94KI. Badanie EM. Mięśnie EDL utrwalono 2% aldehydem glutarowym, utrwalono 1% OsO4 i osadzono w Epon. Skrawki ultrasynowe wybarwiono octanem uranu i zbadano stosując transmisyjny mikroskop elektronowy JEM 1200EX (JEOL). Kultura mięśni, transfekcja i FRAP. Wytwarzanie pierwotnych komórek mięśni szkieletowych myszy i transfekcję przeprowadzono jak opisano wcześniej (19). CDNA dla pełnej długości ludzkiego p94 i jego nieaktywnej proteazy postaci p94: C129S wklonowano do wektora pEGFP (Clontech). Pięć dni po przejściu do pożywki różnicowania, miocyty transfekowane wektorem ekspresyjnym kodującym białko fuzyjne W72 pEN-EGFP, białko fuzyjne p94: C129S-EGFP lub EGFP (wektor próbny pEGFP) poddano analizie FRAP za pomocą konfokalnego mikroskopu LSM510. Regiony zainteresowania wybielono na 30 sekund przy użyciu oprogramowania LSM. W doświadczeniach kontrolnych z użyciem pEGFP, 30 sekund fotowybielania zmniejszyło sygnał EGFP tylko o około 50%, z uwagi na szybką ruchliwość cząsteczek EGFP (patrz Suplementowa Figura 5). Proces FRAP został zarejestrowany przy użyciu oprogramowania LSM. W doświadczeniach FRAP z użyciem EGFP połączonych z p94, względną intensywność EGFP obliczono jako stosunek intensywności EGFP w każdym punkcie czasowym do intensywności przed wybielaniem, a t1 / 2 do odzyskania obliczono jak podano wcześniej (22). Po dziesięć włókien oznaczono ilościowo dla WT p94 i p94: C129S. Aby obliczyć ruchomą frakcję (M1, M2, …) i odzyskiwanie t1 / 2, najpierw wartość początkowego fotowybranego obrazu (t = 0) odjęto od każdego kolejnego obrazu, a wyniki znormalizowano przez ustawienie wstępnego rowka Intensywność do i intensywność początkowego fotowybielonego obrazu (t = 0) do 0. Zastosowano metodę dopasowywania krzywej do ekstrakcji M1 i t1 / 2 z krzywej FRAP, jak wcześniej podano (22). Zastosowano MS-Excel, aby dopasować dane do następującego równania wykładniczego: r = M1 (1. Exp [. K1t]), gdzie R jest względnym powrotem intensywności fluorescencji bielonego obszaru w czasie t, a M1 jest ruchoma część procesu wykładniczego ze stałą szybkości k1. t1 / 2 obliczono jako t1 / 2 = 0,69315 / k1. Należy zauważyć, że to równanie dobrze pasuje do danych, a podwójne dopasowanie wykładnicze nie poprawiło dopasowania. Znakowanie iTRAQ i analiza danych. Bufor (0,5 M wodorowęglan trietyloamoniowy, 0,1% SDS) rozpuszczalne frakcje mięśni TA otrzymano z nietraktowanych myszy WT i p94KI oraz myszy WT-ex i p94KI-ex natychmiast po treningu. Każda próbka (45 .g białka) była mieszaniną równych ilości białka od 3 pojedynczych myszy i znakowana iTRAQ 1 114 (WT), A 115 (p94KI), A 116 (WT-ex), lub A 117 (p94KI). -ex) odczynników zgodnie z instrukcjami producenta (ABI). Próbki poddano frakcjonowaniu (1440 plam), stosując system DiNa LC z HiQ-Sil-SCX, HiQ-Sil-C18-3 i wykrywacz płytek MALDI (KYA Tech), jak opisano wcześniej (44). Spotted frakcje analizowano za pomocą spektrometrii masowej MALDI-TOF (ABI 4800), a białka identyfikowano przy użyciu ProteinPilot 2.0 (ABI) i bazy danych Swiss-Prot
[patrz też: gołębniki świata, nie radzę sobie z emocjami, amc esk ]
[więcej w: apteka hygea zielona góra, zaburzenia afektywne dwubiegunowe, jak dobrze wypaść na rozmowie o pracę ]