Skip to content

Diada limfoblastycznych lizosomalnych proteaz cysteinowych powoduje degradację leku przeciwbiałaczkowego l-asparaginazy czesc 4

1 miesiąc ago

768 words

Na liście znajdują się konserwatywne aminokwasy, korzystne niedopasowania są przedstawione jako dwukropek, neutralne niedopasowania jako okres, a niekorzystne niedopasowania jako przestrzeń. Odszczepione w AEP aminokwasy w ASNazie i odpowiednie aminokwasy w Erwinazie przedstawiono na czerwono. (B) Elastyczna pętla zawierająca N24. Otwarta konformacja jest przedstawiona na czerwono, zamknięta konformacja na niebiesko, N24 na zielono. (C) Przedstawienie powierzchni dostępowej rozpuszczalnika tetrameru ASNazy wytworzonego przy pomocy 7-. promień sondy. N24 jest podświetlony na zielono; N143 jest podświetlony na czerwono. Monomery są pokazane w różnych kolorach. Położenie N24 na odsłoniętej wypukłej powierzchni czyni ją łatwo dostępną dla cięcia AEP. Względna dostępność miejsc cięcia N24 i N143, wzięta razem z obserwacją, że Erwinaza nie jest cięta przez AEP, silnie sugeruje, że AEP początkowo rozszczepia ASNazę na N24 lub N143. N24 jest członkiem pętli odpowiedzialnej za otwieranie i zamykanie kieszeni (31). Figura 5B pokazuje strukturę pętli z nałożonymi otwartymi i zamkniętymi konformacjami. W otwartej konformacji reszta N24 była eksponowana na górze helisy i wystawała na działanie rozpuszczalnika w zamkniętej konformacji; ta pozostałość znajduje się w gaju utworzonym przez interfejs monomer-monomer. Dlatego reszta ta będzie bardziej podatna na cięcie, gdy pętla jest w otwartej konformacji. Aby dodatkowo określić, która z 2 reszt reprezentuje pierwotne miejsce cięcia, oszacowaliśmy dostępność obu miejsc dla AEP. Ponieważ nie ma struktury krystalicznej AEP, przeprowadziliśmy badania modelowania molekularnego (3D-JIGSAW) (32), które przewidywały, że aktywne miejsce AEP leży w głębokiej kieszeni o średnim promieniu około 7 °. Figura 5C pokazuje dostęp powierzchniowy ASNazy narysowanej z promieniem sondy 7 (3. N24 w konformacji w otwartej pętli wyraźnie leży na wypukłej powierzchni, która rozciąga się do otoczenia. W związku z tym jest łatwo dostępny dla AEP. Natomiast N143 jest umieszczony wewnątrz rowka, co utrudnia dostęp do AEP. Sugeruje to, że N24 jest głównym miejscem cięcia przez AEP w cząsteczce ASNazy. Rozszczepienie w tym miejscu może zdestabilizować tetramer, umożliwiając dostęp AEP do innych miejsc cięcia, takich jak D124. Zatem modyfikacja N24 może stworzyć cząsteczkę ASNazy odporną na cięcie AEP. Mutant ASNase N24G jest odporny na cięcie AEP, ale ma zmniejszoną aktywność enzymatyczną. Aby zweryfikować prognozy modelowania molekularnego, zsyntetyzowaliśmy rekombinowane zmukowane asparaginazy N24G, D124G, N143G, N24G / D124G i D124G / N143G. Podstawienie G na resztach N24 i N143 było oparte na sekwencji Erwinazy (Figura 5A). Jak pokazano na Figurze 6 (także Suplementowej Figurze 4), wszystkie 3 mutanty D124 zostały całkowicie zdegradowane przez oczyszczony AEP i prawie tak samo jak lizaty komórkowe. Rekombinant N24G z konserwowaną resztą D124 był jedynym mutantem opornym na cięcie AEP. Potwierdza to, że AEP najpierw rozszczepia natywną ASNazę w N24. Przewiduje się, że cięcie w tej lokalizacji zdestabilizuje tetramer i prawdopodobnie umożliwi dostęp AEP do D124 i N143. Figura 6 Mutant N24G jest odporny na cięcie AEP. Immunobloty handlowych (Medac) i rekombinowanych WT (R-LASNaza) i zmutowanych białek ASNase inkubowanych z (+) i bez (.) Rekombinowanym AEP (0,4. G) lub lizatami pełnokomórkowymi (HRC57). N24G jest odporny na cięcie AEP. Mutanty D124 są całkowicie degradowane przez AEP i lizaty komórkowe. Linie pionowe wyznaczają różne żele; przerywane pionowe linie oznaczają spięte nieciągłe ścieżki wewnątrz żeli. Następnie badaliśmy aktywność enzymatyczną różnych zmutowanych związków ASNazy (tabela 1). Podstawienie N24 przez G w oparciu o sekwencję Erwinzy spowodowało, że mutant był znacznie mniej aktywny w porównaniu z rekombinantem WT (aktywność względna 45%). Mutanty D124G wykazywały minimalną aktywność. Potwierdza to przewidywania dokonane przez modelowanie białek, tj. D124 ma kluczowe znaczenie dla struktury funkcjonalnej ASNazy. Podobnie, N143 nie jest krytycznym miejscem cięcia, ponieważ mutant N143G był podobny do rekombinanta WT, zarówno pod względem aktywności, jak i podatności na cięcie AEP. Tabela Aktywność enzymatyczna różnych rekombinowanych produktów ASNazy Tak więc wydaje się, że aktywność ASNazy zależy nie tylko od D124, ale także od N24. Dalsze symulacje dynamiki molekularnej (MD) rozwikłały ważną funkcję enzymatyczną dla N24. Ścisłe badanie trajektorii MD ujawniło utworzenie międzyłańcuchowego wiązania wodorowego w tetramerze, które przyczynia się do stabilizacji połączenia monomer-monomer (Figura 7A)
[przypisy: enrobioflox 10, jak dobrze wypaść na rozmowie o pracę, szpital okulistyczny poznań ]
[więcej w: olej kokosowy wybielanie zębów, dieta po operacji ginekologicznej, uporczywy kaszel przyczyny ]