Skip to content

Diada limfoblastycznych lizosomalnych proteaz cysteinowych powoduje degradację leku przeciwbiałaczkowego l-asparaginazy cd

1 miesiąc ago

758 words

Wykresy pudełkowe dla każdej kategorii ALL reprezentują rozstęp międzykwartylowy wartości, wąsy reprezentują najmniejsze i największe wartości dla każdej kategorii, a linie poziome i symbole plus oznaczają medianę i średnią; wartości odstające są reprezentowane przez kółka i gwiazdki. (B) Pierwotne limfoblasty wyrażają CTSB i AEP. Immunobloty pierwotnych próbek ALL (UPN, unikalny numer pacjenta) i linie komórkowe. Wykrywane są prekursorowe (56 kDa) i aktywne (36 kDa) formy AEP. Pasma 20 i 25 kDa w blot CTSB reprezentują ciężkie łańcuchy dojrzałych dimerów CTSB; P -actin była kontrolą ładowania. Linie wyznaczają różne żele; linie przerywane oznaczają splątane nieciągłe ścieżki w żelach. (C) Lizaty pierwotnych komórek blastycznych rozszczepiają ASNazę. Odszczepienie jest hamowane przez CTSBi u pacjentów 8 i 10 oraz przez kombinację CTSBi i AEPi u pacjentów 3 i 9. Kontrolę braku lizatu pokazano tylko dla pacjenta 9. AEP degraduje ASNase, ale nie Erwinase. Aby określić swoistość cięcia asparaginazy przez 2 proteazy lizosomalne, inkubowaliśmy oczyszczone rekombinowane AEP i CTSB z różnymi komercyjnymi preparatami asparaginaz. Jak pokazano na Figurze 3, oczyszczony CTSB przecinał zarówno Erwinazę, jak i wszystkie formy komercyjnie dostępnej ASNazy. AEP specyficznie przeciął tylko ASNazę. AEP jest wyrażany przez tkankę nerkową, śledzionową i wątrobową oraz komórki dendrytyczne, ale nie w prawidłowych komórkach białych (26) lub w prekursorowych komórkach B (27). Jest zatem nieprawidłowo wyrażana przez limfoblasty preAB. Ekspresja AEP była głównie obserwowana u pacjentów z wysokim ryzykiem przed ALL B. Są to pacjenci, którzy wykazują również niską aktywność asparaginazy i / lub rozwijają nadwrażliwość. Nasze wyniki sugerują zatem, że AEP moduluje odpowiedź terapeutyczną na ASNazę. W związku z tym zbadaliśmy mechanizm degradacji ASNazy za pośrednictwem AEP. Figura 3CTSB degraduje zarówno ASNazę jak i Erwinazę, podczas gdy AEP jest specyficzna dla ASNazy. Obrazy SDS-PAGE SDS-PAGE barwionych błękitem Coomassie (4 .g) inkubowano z (+) lub bez (.) Ludzkim rekombinowanym CTSB (0,5 .g) (górny panel) lub AEP (0,4 .g) (dolny panel). KIDROLASE i ASNase Medac są handlowymi preparatami ASNazy i są wykrywane jako związki monomeryczne. ONCASPAR jest skoniugowaną z glikolem polietylenowym ASNase Medac ASNase i jest wykrywany jako kompleks o wysokiej masie cząsteczkowej. Modelowanie rozszczepiania AEP ASNazy. Aby określić miejsca cięcia ASEP w AEP, sekwencjonowaliśmy peptydem strawione fragmenty. Analizy sekwencji zidentyfikowały 3 typowe miejsca cięcia AEP w ASNase, N24, D124 i N143 (Figura 4A). Produkty cięcia zachowują nienaruszone znane epitopy komórek B ASNazy (28), co sugeruje, że indukowane AEP cięcie może przyspieszyć prezentację antygenu (29) ASNazy, co prowadzi do nadwrażliwości i / lub rozwoju przeciwciał. Efekty cięcia proteolitycznego modelowano przy użyciu opublikowanej struktury krystalicznej ASNazy (30). Jak pokazano na fig. 4B, ASNase jest aktywny jako tetramer (30). Analizy strukturalne wskazują, że N24 znajduje się na powierzchni tetrameru, w pobliżu miejsca funkcjonalnego. Reszta D124 bezpośrednio stabilizuje miejsce katalityczne, tworząc 2 wiązania wodorowe z atomami szkieletowymi reszt M115 i R116, które są częścią pętli w miejscu aktywnym (Figura 4C). Reszta N143 znajduje się na powierzchni tetrameru i nie znajduje się w pobliżu miejsca aktywnego ani w pobliżu interfejsu monomer-monomer. Tak więc model sugeruje, że rozcięcie lub zastąpienie N24 i D124, ale nie N143, wpłynęłoby na tetrameryzację i / lub katalizę. Dalsze wsparcie dla tego modelu pochodzi z porównania sekwencji aminokwasowych ASNazy i Erwinazy (Figura 5A). Te 2 białka mają identyczność sekwencji 46,5%. Region wokół N24 nie jest wysoce konserwatywny, a G znajduje się w tej pozycji w Erwinase. D124 i sąsiednie aminokwasy są wysoce konserwatywne. Podczas gdy region wokół N143 jest również konserwatywny, sam N143 jest zastąpiony przez G w Erwinazie. Figura 4 Modelowanie białka miejsc rozszczepienia AEP w ASNazie. (A) Sekwencja aminokwasowa ASNase Medac pokazująca miejsca cięcia AEP (podkreślone) zidentyfikowane przez sekwencjonowanie Edmenu N końca. Pozostałość N24 pokazano na czerwono, D124 na zielono, N143 na ciemnoniebieski. Opisane wcześniej potencjalne sekwencje antygenowe pokazano na pomarańczowo, a katalityczne w jasnoniebieskim. (B) Asparaginaza działa jako tetramer, a każdy monomer jest pokazany w oddzielnym kolorze. Aktywne miejsce jest pokazane w reprezentacji przestrzeni kosmicznej. N24 jest podświetlony na czerwono, D124 na zielono, a N143 na ciemny niebieski. (C) Sieć wiązania wodorowego utworzona przez D124 z sąsiadującymi resztami aminokwasowymi M115 i R116 pomaga bezpośrednio stabilizować miejsce katalityczne ASNazy. Figura 5 Modelowanie molekularne sugeruje, że AEP najpierw rozszczepia się przy reszcie N24
[hasła pokrewne: karmienie gołębi pocztowych, zaburzenia afektywne dwubiegunowe, zielnik hodowcy ]
[podobne: jak dobrze wypaść na rozmowie o pracę, szpital okulistyczny poznań, ziarno prawdy online cda ]