Skip to content

Diada limfoblastycznych lizosomalnych proteaz cysteinowych powoduje degradację leku przeciwbiałaczkowego l-asparaginazy ad 8

2 tygodnie ago

695 words

Do detekcji zastosowano sprzężone z HRP drugorzędowe przeciwciała (kozie anty-królicze, kozie anty-mysie z Pierce, Thermo Scientific, osiołki anty-kozie z Santa Cruz Biotechnology Inc.) i zwiększoną reakcję chemiluminescencji (Pierce, Thermo Scientific). Hamowanie cięcia ASNazą. Lizaty całokomórkowe (20 .g) w buforze do trawienia inkubowano wstępnie przez 15 minut w 37 ° C z inhibitorami proteazy, samodzielnie lub w połączeniu. ASNazę (2. 4. G) dodano do reakcji, a następnie inkubowano przez noc w 37 ° C. Inhibitory proteazy obejmowały PIC P8340 CTSBi (1 uM), E64 (0,14 uM) (wszystkie z Sigma-Aldrich), leupeptynę (0,2 uM, Roche) i AEPi (10 uM). P8340 obejmuje inhibitory serynowe, cysteinowe, tiolowe, aminopeptydazowe i aspartylo-proteazowe, ale nie zawiera chelatorów metali. Dopasowanie sekwencji i modelowanie molekularne. Sekwencje białka otrzymano z bazy danych Entrez Protein (numery dostępu P00805 [ASNase] i P06608 [Erwinase]). Ułożenie par białka Lipman-Pearsona dla ASN-azy i Erwinzy przeprowadzono za pomocą MegAlign (DNASTAR) stosując k-ttę 2, kara za przerwę 4 i kara długości przerwy 12. Strukturę kryształu ASNazy uzyskano z banku danych Protein. (nr 42, WPB nr 3ECA). Wszystkie 3 miejsca cięcia zostały zbadane przy użyciu tej struktury krystalicznej. Przeprowadzono analizę strukturalną, aby ujawnić kontekst funkcjonalny każdego miejsca cięcia. Resztki katalityczne ekstrahowano z internetowej bazy danych Atlasu Katalitycznego (33). Zbadano bliskość i interakcje miejsc katalitycznych ASNazy z każdą z 3 reszt rozszczepiających AEP (N24, D124, N143). Przed każdą symulacją MD wszystkie związane cząsteczki substratu (kwas asparaginowy) zostały usunięte. Cząsteczki krystalicznej wody zostały zatrzymane dla ASNazy, ponieważ są one wymagane do prawidłowego funkcjonowania aktywnego miejsca. Asparaginę zastąpiono glicyną w mutancie N24G. Każde białko zostało zanurzone w prostokątnym pudełku z wodą, a Na + i Cl. jony dodano w celu uzyskania stężenia soli 0,2 M. Każdy system następnie minimalizowano i równoważono przez 50 ps w NVT (liczba stałych cząstek przy stałej objętości i temperaturze) i NPT (stała liczba cząstek przy stałym ciśnieniu i temperaturze) z atomami szkieletu powściągliwi na swoje pierwotne pozycje. Po wyrównaniu symulowano każdy system przez 10 ns w temperaturze pokojowej (298K). Wszystkie symulacje i analizy MD zostały przeprowadzone przy użyciu zestawu AMBER (43). Tworzenie mutantów ASNazy, ekspresja białka i oczyszczanie. Pełnej długości sekwencję kodującą ASNazy w wektorze pPT002 (AnsB) w wektorze pPTOT2 (Medac) trawiono XhoI / EcoRI, ligowano do wektora pRSETB (Invitrogen) i transformowano do kompetentnych komórek. Plazmidowy DNA z transformowanych komórek zastosowano do wytworzenia serii mutantów z zastosowaniem ukierunkowanej mutagenezy (Stratagene) i następujących primerów: P1: 5. -GACTCCGCAACCAAATCTGGCTACACAGTGGGTAAAG-3. dla N24G; P2: 5. -ACGTCTATGAGCGCAGGCGGTCCATTCAACCTGT-3. dla D124G; i P3: 5a-TAAAGCCTCCGCCGGTCGTGGCGTGCTG-3. dla N143G. Kombinacje P1 plus P2 i P2 plus P3 zastosowano odpowiednio do wytworzenia mutantów N24G / D124G i D124G / N143G. Wszystkie konstrukty zostały zweryfikowane przez automatyczne sekwencjonowanie DNA. Do ekspresji białka użyto kompetentnych komórek E. coli BL21 (DE3) pLysS. Pojedyncze klony hodowano do OD600 wynoszącego 0,4-0,6, a do indukowania ekspresji białka dodawano izopropylo-P-tiogalaktopiranozyd (MP Biomedicals). Po dodatkowych 4 godzinach komórki zebrano przez odwirowanie i rekombinowane białko ekstrahowano z supernatantu za pomocą lizy osmotycznej w lodowatej wodzie. Dalsze oczyszczanie rekombinowanego białka przeprowadzono w Wacker Chemie AG. Oszacowanie aktywności enzymatycznej. Aktywność enzymatyczną natywnych i zmutowanych ASNaz oszacowano przy użyciu zestawu do ilościowego testu oznaczania aktywności Asparaginase (MAAT), jak opisano wcześniej (44). Mikroskopia. Komórki SD1 znakowano przepuszczalnymi dla komórek sondami fluorescencyjnymi dla aktywnego AEP (AEP-ABP, MM w 37 ° C przez 2 godziny) i dojrzałych endo-lizosomów (100 nM w 37 ° C przez 45 minut; LysoTracker Red DND-99, Molecular Sondy, Invitrogen). Wyznakowane komórki utrwalono następnie (10% obojętna buforowana formalina), permeabilizowano (0,25% Triton X-100 w PBS) i wybarwiono immunologicznie dla LAMP1 (1: 100, BD Biosciences) lub dla AEP (1: 100, R & D Systems), przy użyciu standardowych metod. Obrazy zostały pozyskane na mikroskopie Zeiss Axiovert 7D przy użyciu chłodzonego aparatu o niskim współczynniku pochłaniania światła (EMCCD) aparatu fotograficznego (Photometrics Cascade II: 1024 megapikseli) obsługiwanego przez oprogramowanie MetaMorph FRAP Advanced Imaging (wersja 7.5.2.0; Molecular Devices )
[więcej w: zerwanie więzadła krzyżowego przedniego, dieta po operacji ginekologicznej, zaburzenia afektywne dwubiegunowe ]
[przypisy: lotowanie gołębiami młodymi, pzhgp nowa sól, szpital na traugutta wrocław ]