Skip to content

Diada limfoblastycznych lizosomalnych proteaz cysteinowych powoduje degradację leku przeciwbiałaczkowego l-asparaginazy ad 7

2 tygodnie ago

493 words

Jeśli rzeczywiście takie skojarzenie można zrobić, istnieje wiele możliwości poprawy wyników i zmniejszenia zachorowalności u dzieci z CAŁKOWICĄ poddawaną chemioterapii. Pacjentów można badać przesiewowo pod kątem ekspresji AEP w momencie rozpoznania. Te, które wykazują wysokie poziomy mogą być oferowane Erwinase zamiast ASNase. Umożliwi to optymalne wyczerpanie asparaginy bez wczesnego rozwoju nadwrażliwości. Chociaż oporny na AEP mutant N24G nie jest tak aktywny jak WT, dalsze modelowanie i inżynieria ASNazy są w toku i prawdopodobnie wytwarzają wysoce aktywny enzym, który jest odporny na pękanie. W przyszłości taki syntetyczny produkt mógłby zastąpić obecne produkty bakteryjne. Inną opcją byłoby zastosowanie specyficznych inhibitorów proteazy w połączeniu z terapią ASNazą. AEPi, użyte w tym badaniu, choć przepuszczalne przez komórki, jest nieodwracalne. Do zastosowań terapeutycznych pożądany jest odwracalny inhibitor. Aktualnym celem terapeutycznym w dzieciństwie ALL jest identyfikacja leków ukierunkowanych na specyficzne defekty genetyczne w komórkach białaczkowych, które prowadzą do niepowodzenia terapeutycznego (39). Sposób, w jaki te nowe środki zostaną wprowadzone, pozostaje niejasny, ponieważ obecne strategie leczenia dzieci za pomocą ALL są bardzo skuteczne. Optymalizacja istniejących leków pozostaje zatem praktyczną alternatywą. Rzeczywiście, w ostatnim dziesięcioleciu poprawa wyników w Wielkiej Brytanii odzwierciedla lepsze wykorzystanie istniejących agentów (40, 41). Podczas gdy toksyczność ograniczająca dawkę dla wielu leków stosowanych w terapii ALL została osiągnięta, nie ma to miejsca w przypadku asparaginaz. Nasze badania identyfikują przypuszczalny nowy mechanizm oporności na leki na kluczowy czynnik anty-wirusowy ASNase i prezentują wgląd w zmiany odpowiedzi na ASNazę w dzieciństwie ALL. Zapewnia to platformę do dalszej optymalizacji leczenia asparaginazą z możliwością zmniejszenia zachorowalności i poprawy wyników. Metody Linie komórkowe. Linie komórkowe HRC57, SD1 i REH uzyskano z Departamentu Centralnej Komórki Komórkowej Cancer Research UK. Linię komórkową SupB15 uzyskano z DSMZ (Niemiecka Kolekcja Mikroorganizmów i Kultur Komórkowych). Wszystkie linie komórkowe hodowano w 37 ° C / 5% CO2 w RPMI 1640 GlutaMAX (Invitrogen) z 10% FBS (SLI). Pierwotne próbki ludzkiej białaczki. Nadmiar próbek aspiratu szpiku kostnego uzyskano w momencie rozpoznania u dzieci z ostrą białaczką. Jednojądrzaste komórki izolowano z próbek szpiku przez odwirowanie w gęstości (Lymphoprep; Axis-Shield) i zamrożono w RPMI 1640 z 20% FBS i 10% DMSO. Próbki były przetwarzane wyłącznie od pacjentów, którzy byli leczeni na podstawie krajowych protokołów i którzy wyrazili zgodę na przechowywanie i wykorzystanie nadmiaru materiału do badań zatwierdzonych etycznie. Projekt został zatwierdzony przez lokalną Komisję Etyki Badań Tameside i Glossop, Manchester, Wielka Brytania. Analizy ekspresji genów. Ekspresję genów na komórkach diagnostycznych od 94 ALL i 26 pacjentów z AML analizowano na macierzach oligonukleotydowych Affymetrix HG-U133A przy użyciu platformy GeneSpring 7.3.1 (Agilent Technologies), jak opisano wcześniej (20, 25). Wyniki zostały potwierdzone za pomocą ilościowego PCR (metody dodatkowe). Degradacja ASNazy. Przemyte grudki komórek z linii komórkowych i pierwotne próbki poddano lizie przez zamrażanie i rozmrażanie w buforze do trawienia (50 mM bufor cytrynian trisodowy, pH 4,5, 5 mM DTT). Lizaty sklarowano przez odwirowanie, a supernatanty przechowywano w <80 ° C. W eksperymentach inkubacyjnych od 2 do 4 .g ASNazy (Medac) inkubowano w temperaturze 37 ° C z lizatami pełnokomórkowymi (20 .g) przez noc lub przez 3 godziny z aktywowanym rekombinowanym ludzkim AEP (dostarczonym przez Colin Watts, University of Dundee, Dundee, Wielka Brytania) lub CTSB (R & D Systems). Próbki poddawano immunoblottingowi jak poniżej. Dodatkowe eksperymenty degradacji przeprowadzono przy użyciu Erwinase (Opi Pharma) i alternatywnych preparatów ASNase (KIDROLASE, OPI Pharma, ONCASPAR, Medac GmbH). W celu identyfikacji miejsc cięcia AEP, trawienie ASNazy rozdzielono metodą SDS-PAGE i przeniesiono na membranę PVDF. Prążki zostały następnie wycięte i poddane sekwencjonowaniu aminokwasów na końcu N przez degradację Edmana (Aberdeen Proteomics). Immunoblot. Całkowite białka komórkowe ekstrahowano przy użyciu 0,1% buforu do lizy NP-40 i oznaczano ilościowo za pomocą zmodyfikowanego testu Lowry ego (Bio-Rad). Lizaty umieszczono w 5 × buforze do ładowania próbki i rozdzielono stosując 10% SDS-PAGE. Po transfuzji półwymiarowej membrany PVDF sondowano odpowiednimi pierwszorzędowymi przeciwciałami. Zastosowano następujące pierwszorzędowe przeciwciała: króliczą poliklonalną anty-ASNazę (1: 5000; Abcam), kozę poliklonalną przeciwludzką AEP (1: 2500; R & D Systems), króliczą poliklonalną przeciw-ludzką CTSB (1: 5000; BIOMOL International), i monoklonalną P-aktynę (mysi klon AC-15, 1: 5000, Sigma-Aldrich) [przypisy: szpital na traugutta wrocław, testy osobowości psychologia, karmienie gołębi pocztowych ] [przypisy: enrobioflox 10, zielnik hodowcy, karmienie gołębi pocztowych ]