Skip to content

Diada limfoblastycznych lizosomalnych proteaz cysteinowych powoduje degradację leku przeciwbiałaczkowego l-asparaginazy ad 5

2 tygodnie ago

813 words

W przeciwieństwie do natywnej konformacji, to wiązanie między łańcuchami nie powstało w mutancie N24G (Figura 7B). Ta mutacja wywołuje efekt uderzenia, zakłócając sieć wiązań wodorowych w pobliżu miejsca aktywnego. W rezultacie dolna granica Y25 zmienia swoją konformację. Może to wpływać na pętlę odpowiedzialną za otwieranie i zamykanie kieszeni wiążącej (pozostałości 24 i 25 stanowią część tej pętli). Ponadto stwierdzono, że Y25 ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego umieszczenia i stabilizacji T12 (31), innego członka aktywnego miejsca (33). W natywnej cząsteczce grupa hydroksylowa T12 wskazuje kieszeń wiążącą substrat i jest odpowiedzialna za atak nukleofilowy na substrat. Aby zbadać pozycję grupy hydroksylowej T12 w trakcie symulacji MD, monitorowaliśmy kąt skręcenia łańcucha bocznego, A1, T12. Binarny stan kąta, który orientuje albo grupę hydroksylową, albo metylową T12 w kierunku miejsca aktywnego, pokazano dla natywnego białka (Figura 7C) i mutanta N24G (Figura 7D). Odpowiednia natywna orientacja grupy hydroksylowej T12 w kieszeni wiążącej substrat była utrzymywana podczas symulacji MD dla cząsteczki WT. Jednak symulacja MD w mutancie N24G wykazała, że grupa metylowa T12 zajmowała kieszeń wiążącą substrat przez 34% czasu symulacji. Zatem, T12 w mutancie N24G nie jest w stanie prawidłowo oddziaływać z substratem. Niemniej jednak ta rotacja łańcucha bocznego T12 jest odwracalna w mutancie N24G, wyjaśniając zmniejszoną, ale nie całkowitą, utratę funkcjonalności. Erwinase ma G w pozycji 24 i jest mniej aktywny w porównaniu z ASNase. Symulacje MD dla Erwinase ujawniły, że chociaż orientacja T12 jest podobna dla obu białek, pętla w miejscu aktywnym jest bardziej elastyczna w Erwinase (dane nie pokazane). Może to być przyczyną mniejszej aktywności. Dla wydajnej katalizy pętla w miejscu aktywnym musi zamknąć się na cząsteczce substratu związanej w miejscu aktywnym. Jest prawdopodobne, że bardziej elastyczna aktywna pętla w Erwinazie także czyni go mniej zdolnym do ścisłego zamykania się na cząsteczce substratu, co może częściowo tłumaczyć zmniejszoną aktywność katalityczną Erwinazy. Należy jednak zauważyć, że istnieją również znaczne różnice w sąsiedztwie miejsca aktywnego między Erwinazą i ASNazą (ogólna identyczność sekwencji 47%, pętla w miejscu aktywnym w Erwinazie jest o resztę dłuższa niż w ASNazie), a w konsekwencji, wszystkie bezpośrednie porównania zależności struktura-aktywność pomiędzy 2 asparaginazy mogą być jedynie jakościowe. Figura 7 Zmniejszoną aktywność enzymatyczną mutanta N24G wyjaśniono przez symulacje MD oddziaływań N24. Pokazano sieć wiązania wodorowego wokół N24 w WT ASNase (A) i mutanta N24G (B). Pozostałość T12 jest zabarwiona zgodnie z typami atomów. Kluczowe odległości (in.) Przedstawiają pozycję grupy hydroksylowej T12 względem aktywnego miejsca. Reszty N24 i Y25 mają odpowiednio kolor brązowy i niebieski; inne pozostałości aktywnego miejsca są fioletowe. Dwie reszty, które należą do innego monomeru, ale tworzą wiązania wodorowe (czerwone) z N24 lub Y25, są oznaczone kolorem pomarańczowym (D281) i zielonym (E283). Symulacja MD pokazująca orientację grupy hydroksylowej T12 w odniesieniu do wszystkich 4 miejsc aktywnych w każdym punkcie czasowym podczas symulacji w natywnej ASNazie (C) i zmutowanym N24G (D). Czarna część każdego wykresu reprezentuje frakcję, gdy grupa hydroksylowa T12 jest w prawidłowej orientacji w odniesieniu do 4 miejsc aktywnych. Czerwona część każdego wykresu reprezentuje frakcję, gdy grupa hydroksylowa T12 jest niepoprawnie zorientowana w stosunku do 4 miejsc aktywnych (metyl zamiast grupy hydroksylowej skierowanej w stronę centrum aktywnego miejsca). Aktywny AEP ulega ekspresji w obwodowym odcinku lizosomalnym w limfoblastach. Aby lepiej zrozumieć możliwe interakcje AEP z ASNazą, zbadaliśmy lokalizację aktywnego AEP w komórkach SD1. Oznakowanie za pomocą sondy opartej na aktywności (AEP-ABP) (34) potwierdziło, że AEP jest wyrażany przez komórki SD1, ale nie przez REH i SupB15 (Suplementowa Figura 5A). W schemacie wybarwienia AEP w SD1 występuje znaczna heterogeniczność międzykomórkowa i wewnątrzkomórkowa, przy czym obserwuje się zarówno punktowe, jak i agregatowe wzorce barwienia (dodatkowa Figura 5, B i C). Jak pokazano na Figurze 8A, AEP kolokalizuje się z kwaśną sondą LysoTracker Red, przypuszczalnie dla dojrzałych lizosomów. Tak więc, nasze wyniki potwierdzają poprzednią obserwację, że prekursor AEP i dojrzałe aktywne białko są zlokalizowane w odrębnych wewnątrzkomórkowych przedziałach pęcherzykowych endosomalnych / lizosomalnych i kwasowych (35). Jednakże, w przeciwieństwie do wyników wcześniejszego raportu, w których stwierdzono, że aktywny AEP jest głównie okołojądrowym, aktywnym AEP w komórkach SD1 umiejscowionych na obwodzie komórki w dobrze zdefiniowanym białku błonowym związanym z lizosomem (pozytywnym (LAMP1-dodatni ) przedziały (rysunek 8B i rysunek dodatkowy 5D)
[przypisy: apteka hygea zielona góra, uporczywy kaszel przyczyny, karma dla owczarka niemieckiego ]
[przypisy: magnetyczny rezonans jądrowy, karma dla owczarka niemieckiego, zerwanie więzadła krzyżowego przedniego ]